によるエクソン介在物評価スプライスの SMA 患者の繊維芽細胞でスイッチング アンチセンスオリゴヌクレオチド
Summary
エクソン インクルー ジョン (スプライス変調) を誘導し、脊髄性筋萎縮症 (SMA) の召式を救出様々 なアンチセンスオリゴヌクレオチド (AONs) が示されています。ここでは、エーオン lipotransfection エクソン包含SMN2遺伝子の SMA 患者の繊維芽細胞の有効性を判断する評価方法を誘導するためのプロトコルについて述べる。
Abstract
脊髄性筋萎縮症 (SMA)、 SMN1の損失によって引き起こされる致命的な神経疾患がアンチセンス オリゴヌクレオチド (AON) の分野でユニークなケースを提示-療法を介した。SMN1遺伝子の変異は、病気の責任ですが、 SMN2のイントロンのスプライシング サイレンサー (ISS) 部位をターゲット AONs は召式を復元し、症状を改善する示されている FDA 承認 nusinersen を含みます。現在、SMA のエーオン療法を含む多くの研究は、小説エーオン化学SMN2 nusinersen よりもより効果的なより少ない有毒ことができるターゲットの調査に焦点を当てます。ここでは、AONs 続いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) と西部にしみが付くことの lipotransfection を使用してエクソン介在物の in vitro評価のためのプロトコルについて述べる。このメソッドは、エーオン化学の様々 なタイプに流用できます。このメソッドを使用して、ことを示す AONs から成る交互ロックされた核酸 (Lna) 効率的なのSMN2エクソン インクルー ジョンと非常に低濃度としたがって、LNA でサンタマリアノヴェッラタンパク質の回復につながる DNA ヌクレオチド (LNA/DNA mixmers)/DNA mixmer ベース アンチセンスオリゴヌクレオチド遺伝的疾患によるスプライシングの欠陥を治療するために魅力的な治療戦略があります。ここで説明の in vitro評価法は、迅速、簡単、かつ様々 な新規 AONs のテスト十分に敏感です。
Introduction
脊髄性筋萎縮症 (SMA) は、常染色体劣性パターンで継承された致命的な神経筋疾患です。それは、運動ニューロンと進歩的な体幹および下肢筋麻痺1,2の低下が特徴です。SMA の出現の大半は生存運動ニューロン 1 (SMN1) 遺伝子3のホモ接合体変異が原因です。生存運動ニューロン 2 (SMN2) 遺伝子はSMN1の逆複製で、ほぼ同じシーケンスのみ 5 拠点4,5によって異なります。SMN2エクソン 7 にある C-T 転移は突然変異が不可欠であるエクソンSMN2コピー (図 1、) のほぼ 90% で除外されて 7 につながるのでほぼ機能しない遺伝子を作る。エクソン 7 を行方不明SMN2 Mrna は、その蛋白質の製品は安定していないが急速に低下、 SMN1関数の補正はできません。
アンチセンス療法は最近 SMA6を治療するための非常に有望な戦略として浮上しています。米国食品医薬品局 (FDA) によって nusinersen の最近の承認は最初の薬 SMA7を治療するために利用可能にしました。Nusinersen は、2 ‘-O-メトキシエチル変更 (萌) ホスホロチオエート バックボーンと 18 mer アンチセンス オリゴヌクレオチド (AON) です。薬剤ターゲット イントロンのスプライシング サイレンサー N1 (ISS N1) 第 7 SMN2遺伝子のイントロンであります。ISS n1 nusinersen の結合はエクソン 7 包有物 (図 1、)8,9,10 を誘導することによって内因性のSMN2遺伝子から機能のフルレングス召蛋白質の表現の回復を促進します。.現在、SMA のエーオン療法を含む多くの研究は、nusinersen よりもより効果的なより少ない毒性があります小説エーオンの化学的性質の調査に焦点を当てます。それは、他の化学と AONs も効率的にエクソンSMN2エクソン 7 含有を誘発する実証されている生体外でそして生体内の11,12,13。
ロックされた核酸 (Lna)、化学修飾 RNA アナローグ 2 ′-酸素フラノース構造 (図 1b)14,15以内と 4 ′-炭素を結ぶメチレン橋です。Dna または Rna に比べると、Lna は相補的な RNA シーケンスにバインドするための高親和性があるし、内因性核酸に強いという利点を持っています。LNA 化学は、qPCR16,17蛍光その場で交配 (魚) のためのプローブとして使用するため適用されています。また、それを利用する遺伝子発現調節の in vitroとin vivoの両方。GapmeR AONs は、5 ‘と 3’ 端に複数の Lna が並ぶ単一座礁させた DNA の分子の組み合わせです。彼らはターゲット Mrna、活性化リボヌクレアーゼ H18が低下する原因とする相補的な結合による遺伝子発現ノックダウンします。LNA/DNA mixmers は、Lna の間に統合された DNA ヌクレオチドから成る AONs です。この向きで提示彼らはその関数 (LNA antimiR)19を阻害する miRNA をバインドできます。いくつかの LNA antimiRs 臨床開発に達しています。例については、miravirsen (AntimiR-122) は c 型肝炎を治療するためにミール 122 を阻害する LNA antimiR といくつかのフェーズ II 臨床試験が現在進行中19,20。最近、LNA/DNA mixmers もまた RNA スプライシング21に調節をすることが実証されています。それ mRNA の特定のシーケンスにバインドでき、ジストロフィンの mRNA とエクソンのインクルー ジョンSMN2 mRNA体外13,22.のエクソンを誘発します。
この記事では、エクソン含める RNA および蛋白質レベルで AONs と有効性の評価を使用しての誘導のための方法論を概説します。この方法を実証するため、 SMN2のイントロン 7 年目標は ISS N1 LNA/DNA mixmers を使用しました。Lipotransfection による SMA 患者細胞にトランスフェクション AONs による最終SMN2コピーおよび召蛋白質の生産のアップレギュレーションのエクソン 7 含有。エクソンを含めることを誘発する LNA/DNA mixmers を使用する利点の 1 つは、トランスフェクションの効果的な濃度は他の化学13よりかなり低いです。このメソッドは、phosphorodiamidate morpholino オリゴマー (PMOs) 遠藤ポーターの共トランスフェクション試薬によるエンドサイトーシスによって細胞を入力する必要のある、その電荷は中性のためを除いて他の多くの AONs を使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明の in vitro評価法は、迅速、簡単、かつ様々 な AONs のテスト十分に敏感です。このプロトコルは、エクソン スキップや他の遺伝子や様々 なセルの種類を含めることに広く適用されます。さらに、このメソッドを使用して (PMOs) を除くほとんどのエーオン化学を導入することができます。AONs は内因性、人為的に導入された遺伝子の mRNA の選択的スプライシングを調節すること…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者はニコール McRorie の実験の助けをありがちましょう。この作品は、アルバータ大学の医学、歯学、・ スリプチュク SMA 研究財団研究助成金、カナダ保健研究機構 (機構)、友人のギャレット カミング研究資金、HM のトゥーピン神経学部によって支えられました。科学研究費、筋ジストロフィー カナダ、イノベーション、アルバータ州企業と高等教育と女性や子供の健康研究所 (WCHRI) のカナダの基礎。
Materials
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| ∆7 SMN2 forward: | TCTGGACCACCAATAATTCCCC | ||
| ∆7 SMN2 reverse: | ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
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