Evaluatie van de opname van de Exon geïnduceerd door Splice switch Antisense Oligonucleotides in SMA patiënt fibroblasten
Summary
Verschillende antisense oligonucleotides (AONs) hebben aangetoond dat induceren exon integratie (splice modulatie) en SMN expressie voor spinale musculaire atrofie (SMA) te redden. Hier beschrijven we een protocol voor AON lipotransfection ertoe exon opneming in het SMN2 -gen en de evaluatiemethoden te bepalen van de werkzaamheid bij SMA patiënt fibroblasten.
Abstract
Spinale musculaire atrofie (SMA), een dodelijke neurologische ziekte die wordt veroorzaakt door het verlies van SMN1, presenteert een uniek geval op het gebied van antisense oligonucleotide (AON)-gemedieerde therapie. Terwijl SMN1 mutaties verantwoordelijk zijn voor de ziekte, AONs gericht op intronic splice demper (ISS) sites in SMN2, met inbegrip van de FDA-goedgekeurde nusinersen, hebben aangetoond dat herstellen SMN expressie en verbetering van de symptomen. Op dit moment veel studies waarbij AON therapie voor SMA richten op onderzoek naar nieuwe AON oplossingen gericht op SMN2 , die mogelijk meer effectieve en minder toxisch dan nusinersen. Hier beschrijven we een protocol voor in vitro evaluatie van exon integratie met behulp van lipotransfection van AONs gevolgd door omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR), kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR), en het westelijke bevlekken. Deze methode kan worden gebruikt voor verschillende soorten AON chemicaliën. Met behulp van deze methode, wij laten zien dat AONs samengesteld uit afwisselende vergrendelde nucleic zuren (LNAs) en DNA nucleotiden (LNA/DNA mixmers) tot efficiënte SMN2 exon insluiting en herstel van het SMN-eiwit op een zeer lage concentratie, en daarom, LNA leiden / DNA mixmer gebaseerde antisense oligonucleotides mogelijk een aantrekkelijke therapeutische strategie voor de behandeling van splicing defecten veroorzaakt door genetische ziekten. De in vitro evaluatie hier beschreven methode is snel, eenvoudig en gevoelig genoeg voor het testen van verschillende nieuwe AONs.
Introduction
Spinale musculaire atrofie (SMA) is een fatale neuromusculaire aandoening overgenomen in een autosomaal recessief patroon. Het wordt gekenmerkt door de afbraak van motorische neuronen en progressieve romp en ledematen spier verlamming1,2. De meerderheid van de SMA exemplaren zijn te wijten aan een homozygoot mutatie in de overleving van motor neuron 1 (SMN1) gen3. Het voortbestaan van de motor neuron 2 (SMN2) gen is een omgekeerde duplicaat van SMN1, en heeft een bijna identieke reeks uiteenlopende door slechts vijf basissen4,5. Een C-te-T-overgang in SMN2 gelegen in exon 7 maakt het gen bijna omdat de mutatie leidt tot de essentiële exon 7 buitengesloten in bijna 90% van de SMN2 afschriften (Figuur 1een). SMN2 mRNAs ontbrekende exon 7 compensatie geen voor de SMN1 -functie, omdat haar eiwit product onstabiel is en is snel afgebroken.
Antisense therapie onlangs naar voren gekomen als een veelbelovende strategie voor de behandeling van SMA6. De recente goedkeuring van nusinersen door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) het het eerste medicijn ter beschikking gesteld voor de behandeling van SMA7. Nusinersen is een 18-mer antisense oligonucleotide (AON) met een wijziging van de 2 ‘-O-methoxyethyl (MOE) en de ruggengraat van een phosphorothioate. De drug richt zich op de intronic splicing geluiddemper N1 (ISS-N1) gelegen in intron 7 van de SMN2 -gen. Binding van nusinersen aan ISS-N1 bevordert het herstel van functionele full-length SMN-eiwit expressie van de endogene SMN2 gen door inducerende exon 7 integratie (Figuur 1een)8,9,10 . Op dit moment veel studies waarbij AON therapie voor SMA richten op onderzoek naar nieuwe AON chemicaliën die meer effectieve en minder toxisch dan nusinersen kunnen. Is gebleken dat de AONs met andere chemicaliën ook efficiënt exon opneming in SMN2 exon 7 veroorzaken zowel in vitro als in vivo11,12,13.
Vergrendelde nucleic zuren (LNAs) zijn chemisch gewijzigde RNA-analogen met een brug van de methyleen verbindt de 4 ‘ –koolstof met de 2′ –zuurstof binnen de furanose structuur (Figuur 1b)14,15. In vergelijking met Ani of RNAs, LNAs hebben een grotere affiniteit voor binding aan aanvullende RNA-sequenties en hebben het extra voordeel van het zijn zeer resistent tegen endogene nucleasen. Het LNA-chemie is toegepast voor gebruik als sondes voor fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en in qPCR16,17. Ook, het wordt gebruikt voor het regelen van genexpressie zowel in vitro als in vivo. GapmeR AONs zijn een combinatie van single-stranded DNA moleculen geflankeerd door verschillende LNAs op de 5 ‘ en 3 ‘ einden. Ze neerslaan genexpressie door bindende aanvulling op gerichte mRNAs, waardoor ze worden afgebroken door het geactiveerde RNase H-18. LNA/DNA mixmers zijn AONs die bestaan uit DNA nucleotiden geïntegreerd tussen LNAs. Gepresenteerd in deze oriëntatie kunnen zij binden miRNA voor de remming van de functie (LNA-antimiR)19. Sommige LNA-antimiRs gekomen klinische ontwikkeling. Bijvoorbeeld, miravirsen (AntimiR-122) is een LNA-antimiR dat miR-122 voor de behandeling van hepatitis C infectie remt en verschillende fase II klinische proeven zijn momenteel lopende19,20. Onlangs is gebleken dat mixmers LNA/DNA ook RNA splicing21kunt moduleren. Het kan een specifieke opeenvolging van mRNA binden en induceren exon skipping in Dystrofine mRNA en exon deelname SMN2 mRNA in vitro13,22.
In dit artikel duidelijk naar voren komt een methodologie voor de inductie van exon integratie met behulp van AONs en de evaluatie van de werkzaamheid op het niveau van RNA en eiwitten. Om deze methode te illustreren, hebben we het LNA/DNA-mixmers dat targeting van ISS-N1 in intron 7 van SMN2gebruikt. AONs door lipotransfection in SMA patiënt cellen transfected geïnduceerde exon 7 opname in de definitieve SMN2 transcript en opregulatie van SMN eiwitproductie. Een van de voordelen van het gebruik van LNA/DNA mixmers voor het opwekken van de exon-integratie is dat de effectieve concentratie voor de transfectie beduidend lager dan andere oplossingen13 is. Deze methode kan worden gebruikt voor vele andere AONs met uitzondering van phosphorodiamidate morfolino oligomeren (PMOs), die, als gevolg van hun neutrale lading, moeten cellen via endocytose geïnduceerd door de Endo-Porter co transfectiereagens invoeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in vitro evaluatie hier beschreven methode is snel, eenvoudig en gevoelig genoeg voor het testen van verschillende AONs. Dit protocol is breed inzetbaar exon skipping en opname van andere genen en verschillende celtypes. Daarnaast kunnen meeste AON doorgaan (met uitzondering van PMOs) met behulp van deze methode zijn transfected. AONs kan splitsen van pre-mRNA van zowel endogene als kunstmatig geïntroduceerde genen kunnen regelen, en mede-transfected met plasmide vectoren uitvoering van gerichte genen.
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Nicole McRorie voor hulp met de experimenten. Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Alberta faculteit geneeskunde en tandheelkunde Slipchuk SMA onderzoeksbeurs Stichting onderzoek, de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR), de vrienden van Garrett Cumming middelen voor onderzoek, neurologisch HM Toupin Middelen voor het onderzoek van wetenschap, de spierdystrofie Canada, de Stichting van Canada voor innovatie, Alberta Enterprise en geavanceerde onderwijs, en de vrouwen en kinderen Health Research Institute (WCHRI).
Materials
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| ∆7 SMN2 forward: | TCTGGACCACCAATAATTCCCC | ||
| ∆7 SMN2 reverse: | ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
- Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
- Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
- Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
- Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).
- Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
- Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
- Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).
- Obika, S., et al. Synthesis of 2′-O,4′-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
- Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
- Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
- Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
- Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
- Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).
- Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
- Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).
- Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
- Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
- Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
- Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2′-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2′-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
- Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).
