Évaluation de l’Inclusion d’Exon induite par Splice commutation oligonucléotides antisens de fibroblastes de patients de SMA
Summary
Induire l’inclusion exon (modulation d’épissure) et expression de SMN pour l’atrophie musculaire spinale (SMA) de sauvetage ont démontré différents oligonucléotides antisens (NAO). Nous décrivons ici un protocole pour lipotransfection AON induire l’inclusion d’exon du gène SMN2 et les méthodes d’évaluation pour déterminer l’efficacité chez les patients fibroblastes SMA.
Abstract
Atrophie musculaire spinale (SMA), une maladie neurologique mortelle causée par la perte du SMN1, présente un cas unique dans le domaine des oligonucléotides antisens (AON)-médiation thérapeutique. Tandis que SMN1 mutations sont responsables de la maladie, Nao ciblant les sites d’épissage intronic silencieux (ISS) SMN2, y compris nusinersen approuvé par la FDA, a été démontré pour restaurer expression SMN et atténuer les symptômes. Actuellement, de nombreuses études portant sur la thérapie AON pour SMA se concentrent sur l’étude des nouvelles chimies AON ciblage SMN2 qui peut être plus efficace et moins toxique que nusinersen. Nous décrivons ici un protocole pour l’évaluation de in vitro de l’inclusion d’exon à l’aide de lipotransfection de Nao, suivie de la chaîne par polymérase transcription inverse (RT-PCR), PCR quantitative (qPCR) et Western Blot. Cette méthode peut être utilisée pour différents types de chimies AON. En utilisant cette méthode, nous démontrons que Nao composé d’alternance des acides nucléiques verrouillés (LNA) et nucléotides de l’ADN (LNA/ADN mixmers) conduisent à efficace de SMN2 exon inclusion et de restauration des protéines SMN à une concentration très faible et par conséquent, LNA / Oligonucléotides antisens axée sur les mixmer de l’ADN peuvent être une stratégie thérapeutique séduisante pour traiter l’épissage défauts causés par des maladies génétiques. La méthode évaluation in vitro décrite ici est rapide, facile et assez sensible à l’essai de divers nouveaux NAO.
Introduction
Atrophie musculaire spinale (SMA) est un trouble neuromusculaire mortels hérité dans une transmission autosomique récessive. Elle est caractérisée par la dégradation des neurones moteurs et tronc progressive et branche musculaire paralysie1,2. La majorité des événements de SMA est due à une mutation homozygote dans le gène de la survie des neurones moteurs 1 (SMN1)3. Le gène de la survie des neurones moteurs 2 (SMN2) est un doublon inverse du SMN1et a une séquence presque identique différant par seulement cinq bases4,5. Une transition de C-à-T en SMN2 situé dans l’exon 7 rend le gène presque ne fonctionne pas parce que la mutation conduit à l’essentiel exon 7 étant exclu dans près de 90 % des transcriptions de SMN2 (Figure 1a). MRNA SMN2 manquant exon 7 ne peut pas compenser la fonction SMN1 parce que son produit protéique est instable et se dégrade rapidement.
La thérapie antisense a récemment émergé comme une stratégie prometteuse pour le traitement des SMA6. La récente approbation de nusinersen par la U.S. Food et pharmaceutiques (FDA) en fait le premier médicament disponible pour traiter la SMA7. Nusinersen est un oligonucléotide antisens 18-mer (AON) avec une modification de la 2 ‘-O-methoxyethyl (MOE) et une colonne vertébrale phosphorothioate. Le médicament cible le silencieux épissage intronic N1 (ISS-N1) situé dans l’intron 7 du gène SMN2 . Liaison de la nusinersen à ISS-N1 favorise la récupération de l’expression des protéines SMN pleine longueur fonctionnelle du gène SMN2 endogène en induisant l’exon 7 inclusion (Figure 1a)8,9,10 . Actuellement, de nombreuses études portant sur la thérapie AON pour SMA se concentrent sur l’étude des chimies AON roman qui peuvent être plus efficace et moins toxique que nusinersen. Il a été démontré que Nao avec autres chimies induire aussi efficacement inclusion exon dans l’exon SMN2 7 fois in vitro et in vivo11,12,13.
Acides nucléiques verrouillés (LNA) sont des analogues de RNA chimiquement modifiés contenant un pont méthylène reliant le 4′ –carbone avec la 2′ –oxygène dans les furanoses structure (Figure 1b)14,15. Comparé à l’ADN ou d’ARN, LNA ont une affinité accrue pour la liaison aux séquences d’ARN complémentaires et ont l’avantage d’être très résistant aux nucléases endogènes. La chimie de la LNA a été appliquée pour une utilisation comme sondes d’hybridation in situ par fluorescence (FISH) et qPCR16,17. Par ailleurs, il est utilisé pour réguler l’expression génique in vitro et in vivo. GapmeR Nao sont une combinaison de molécules d’ADN simple brin flanqué de LNA plusieurs extrémités 5′ et 3′. Ils démantèlent l’expression des gènes en se liant complémentaires de l’ARNm ciblés, obligeant à être dégradé par les activés de la RNase H18. Mixmers LNA/ADN sont Nao qui se composent de nucléotides d’ADN intégrés entre LNA. Présenté dans cette orientation ils peuvent lier miRNA inhibe sa fonction (LNA-antimiR)19. Certains LNA-antimiRs ont atteint le développement clinique. Pour obtenir des exemples, miravirsen (AntimiR-122) est un LNA-antimiR qui inhibe miR-122 pour traiter l’infection par le virus de l’hépatite C et plusieurs essais cliniques de Phase II sont actuellement en cours de19,20. Récemment, il a été démontré que LNA/ADN mixmers peut aussi moduler RNA épissage21. Il peut lier une séquence spécifique d’ADN messagère et induire exon skipping en dystrophine ARNm et exon inclusion dans SMN2 mRNA in vitro13,22.
Dans cet article, nous décrivons une méthodologie pour l’induction de l’inclusion d’exon à l’aide de la NAO et l’évaluation de l’efficacité au niveau de l’ARN et de protéine. Pour illustrer cette méthode, nous avons utilisé le mixmers LNA/ADN ciblage ISS-N1 dans l’intron 7 de SMN2. Nao transfectés dans des cellules de patients de SMA par lipotransfection induite par l’inclusion d’exon 7 dans la transcription finale de SMN2 et l’augmentation de la production de protéine SMN. Un des avantages d’à l’aide de LNA/ADN mixmers pour induire l’inclusion de l’exon est que la concentration effective pour la transfection est significativement plus faible que les autres chimies13. Cette méthode peut être utilisée pour de nombreux autres Nao sauf phosphorodiamidate morpholino oligomères (OMP), qui, en raison de leur charge neutre, doivent entrer dans les cellules par endocytose induite par le réactif de transfection co Endo-Porter.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode évaluation in vitro décrite ici est rapide, facile et assez sensible pour l’essai des plus diverses. Ce protocole est largement applicable à exon skipping et l’inclusion d’autres gènes et divers types de cellules. En outre, la plupart chimies AON (sauf PMOs) peuvent transfecter à l’aide de cette méthode. Nao peut réglementer l’épissage d’un pré-ARNm des gènes endogènes et artificiellement introduits et peut être co-transfectées avec des vecteurs de plasmide porteur de gènes …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Nicole McRorie pour aider avec les expériences. Ce travail a été soutenu par la faculté de l’Université de l’Alberta de médecine et dentisterie, Slipchuk SMA subvention de recherche de recherche Fondation, les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), les amis du Fonds de recherche de Cumming de Garrett, HM Toupin neurologique Fonds de la recherche scientifique, la dystrophie musculaire Canada, la Fondation canadienne pour l’Innovation, entreprise de l’Alberta et l’enseignement postsecondaire et les femmes et les enfants Health Research Institute (WCHRI).
Materials
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| ∆7 SMN2 forward: | TCTGGACCACCAATAATTCCCC | ||
| ∆7 SMN2 reverse: | ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
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