Avaliação da inclusão Exon induzida pela Splice Oligonucleotides Antisentidos comutação em fibroblastos de paciente de SMA
Summary
Vários oligonucleotídeos antisenso (AONs) foram mostrados para induzir exon inclusão (modulação da tala) e resgatar a expressão SMN para atrofia muscular espinhal (SMA). Aqui, descrevemos um protocolo para lipotransfection AON induzir inclusão exon do gene SMN2 e os métodos de avaliação para determinar a eficácia em pacientes fibroblastos SMA.
Abstract
Atrofia muscular espinhal (SMA), uma doença neurológica letal causada pela perda de SMN1, apresenta um caso único no campo do oligonucleotide antisentido (AON)-mediada por terapia. Enquanto SMN1 mutações são responsáveis pela doença, AONs tala intrônicas silenciador (ISS) em sítios em SMN2, incluindo nusinersen aprovado pela FDA, foram mostrados para restaurar a expressão SMN e amenizar os sintomas. Atualmente, muitos estudos envolvendo terapia AON para SMA focar investigando romance químicos AON direcionamento SMN2 que pode ser mais eficaz e menos tóxico do que nusinersen. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliação em vitro de exon inclusão usando lipotransfection de AONs seguido por reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR), reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e mancha ocidental. Esse método pode ser empregado para vários tipos de produtos químicos da AON. Usando esse método, demonstramos que AONs composto de alternadas (LNAs) os ácidos nucleicos bloqueados e nucleotídeos do DNA (LNA/DNA mixmers) levam a eficiente SMN2 exon inclusão e restauração da proteína SMN em uma concentração muito baixa e portanto, LNA / Oligonucleotides antisentido baseado em mixmer de DNA podem ser uma estratégia terapêutica atraente para tratar a emenda defeitos causados por doenças genéticas. O in vitro avaliação método descrito aqui é rápido, fácil e sensível o suficiente para o teste de vários AONs romance.
Introduction
Atrofia muscular espinhal (SMA) é uma desordem neuromuscular fatal herdada em um padrão autossômico recessivo. É caracterizado pela degradação dos neurônios motores e tronco progressivo e21,paralisia do músculo membro. A maioria das ocorrências de SMA são devido a uma mutação homozigótica no gene de sobrevivência do neurônio motor 1 (SMN1)3. O gene de sobrevivência do neurônio motor 2 (SMN2) é uma duplicata inversa de SMN1e tem uma sequência praticamente idêntica, diferindo por apenas cinco bases4,5. Uma transição de C-a-T em SMN2 localizado no exon 7 faz o gene quase não funcionam porque a mutação leva o essencial exon 7 sendo excluídos em quase 90% de SMN2 transcrições (Figura 1um). MRNAs SMN2 faltando exon 7 não pode compensar a função SMN1 porque seu produto proteico é instável e é rapidamente degradado.
Terapia antisentida recentemente emergiu como uma estratégia promissora para o tratamento de SMA6. A recente aprovação de nusinersen por o E.U. Food and Drug Administration (FDA) disponibilizou o primeiro medicamento para o tratamento de SMA7. Nusinersen é uma 18-mer antisentido oligonucleotide (AON) com uma modificação de 2 ‘-O-metoxietílico (MOE) e um backbone phosphorothioate. A droga alveja o silenciador emenda intrônicas N1 (ISS-N1) localizado no intron 7 do gene SMN2 . Ligação de nusinersen de ISS-N1 promove a recuperação funcional expressão de proteína SMN completos do gene SMN2 endógenos induzindo exon 7 inclusão (Figura 1um)8,9,10 . Atualmente, muitos estudos envolvendo terapia AON para SMA focar investigando romance químicos AON que podem ser mais eficaz e menos tóxico do que nusinersen. Foi demonstrado que AONs com outros químicos induzem também eficientemente exon inclusão em SMN2 exon 7 tanto in vitro e in vivo11,12,13.
Ácidos nucleicos bloqueados (LNAs) são modificados quimicamente análogos de RNA contendo uma ponte metileno conectando ocarbono 4 ‘ – com o 2 ‘ –oxigênio dentro da estrutura (Figura 1b) de furanose14,15. Em comparação com DNAs ou RNAs, LNAs têm uma maior afinidade para ligação a sequências de RNA complementares e têm o benefício adicionado de ser altamente resistente à nucleases endógenas. A química do LNA foi aplicada para uso como sondas de fluorescência em situ da hibridação (peixe) e qPCR16,17. Além disso, é utilizado para regular a expressão gênica tanto in vitro e in vivo. GapmeR AONs são uma combinação de moléculas de ADN single-stranded, ladeado por vários LNAs nas extremidades 5 ‘ e 3 ‘. Eles Derrubem a expressão gênica por ligação complementares de mRNAs alvo, levando-os a ser degradada por RNase H registrados18. LNA/DNA mixmers são AONs que são compostas de nucleotídeos do DNA integrados entre LNAs. Apresentados na presente orientação eles podem vincular miRNA para inibir sua função (LNA-antimiR)19. Alguns LNA-antimiRs atingiram o desenvolvimento clínico. Para exemplos, miravirsen (AntimiR-122) é um LNA-antimiR que inibe a miR-122 para tratar a infecção da hepatite C e vários ensaios clínicos de fase II estão actualmente em curso19,20. Recentemente, foi demonstrado que o LNA/DNA mixmers também pode modular21o splicing de RNA. Pode ligar uma sequência específica de mRNA e induzir exon saltando na inclusão de mRNA e exon distrofina em SMN2 mRNA em vitro13,22.
Neste artigo, descrevem uma metodologia para a indução do exon inclusão usando AONs e a avaliação de eficácia a nível do RNA e proteína. Para exemplificar este método, usamos o LNA/DNA mixmers direcionamento ISS-N1 no intron 7 de SMN2. AONs transfectadas em SMA pacientes células por lipotransfection induziram exon 7 inclusão no final SMN2 transcrição e upregulation de produção de proteína SMN. Uma das vantagens de usar o LNA/DNA mixmers para induzir a exon inclusão é que a concentração eficaz para o transfection é significativamente menor do que outros produtos químicos13. Esse método pode ser usado para muitos outros AONs exceto phosphorodiamidate Morpholinos oligómeros (PMOs), que, devido a sua carga neutra, precisam inserir células através de endocitose induzida pelo reagente de transfeccao co Endo-Porter.
Protocol
Representative Results
Discussion
O in vitro avaliação método descrito aqui é rápido, fácil e sensível o suficiente para o teste de vários AONs. Este protocolo é amplamente aplicável a exon saltando e inclusão de outros genes e vários tipos de células. Além disso, a maioria dos produtos químicos AON (exceto PMOs) podem transfected usando esse método. AONs pode regular a emenda de pre-mRNA de genes endógenos e artificialmente introduzidos e pode ser co transfectadas com vetores de plasmídeo carregando genes alvo.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Nicole McRorie ajuda com os experimentos. Este trabalho foi apoiado pela faculdade de medicina e odontologia, Slipchuk SMA Research Foundation Research Grant, institutos canadenses de pesquisa da saúde (CIHR), os amigos de Garrett Cumming pesquisa fundos, HM Toupin neurológico da Universidade de Alberta Fundos de investigação científica, o Canadá de Distrofia Muscular, a Fundação do Canadá para a inovação, Alberta Enterprise e educação avançada e as mulheres e das crianças Instituto de pesquisa de saúde (WCHRI).
Materials
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' to 3' | ||
| SMN2 forward: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 reverse: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH forward: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH reverse: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| full-length SMN2 forward: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| full-length SMN2 reverse: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| ∆7 SMN2 forward: | TCTGGACCACCAATAATTCCCC | ||
| ∆7 SMN2 reverse: | ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC | ||
| GAPDH forward: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH reverse: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Cathode Buffer | 0.025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0.03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Concentred Anode Buffer | 0.3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membrane | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer for Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
References
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
- Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
- Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
- Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
- Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
- Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
- Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).
- Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
- Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
- Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
- Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).
- Obika, S., et al. Synthesis of 2′-O,4′-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
- Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
- Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
- Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
- Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
- Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
- Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).
- Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
- Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).
- Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
- Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
- Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
- Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2′-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2′-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
- Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).
