Integrar imágenes de citometría de flujo y transcriptómicos perfilado para evaluar trata de CD1d endocíticas alterada
Summary
Imágenes de citometría de flujo proporciona un enfoque ideal para detectar la alteración morfológica y funcional de las células a nivel individual y poblacional. Alteración función endocíticas para la presentación de antígeno lípido en las células dendríticas humanas expuestas al contaminante se demostró con un combinado transcriptómicos de perfiles de expresión génica y manifestación morfológica de la proteína trata.
Abstract
Análisis poblacionales de la alteración morfológica y funcional de proteínas endocíticas son difíciles debido a la demanda de captura de la imagen en un análisis estadístico y nivel de la imagen de unicelular a nivel poblacional. Para superar esta dificultad, utilizamos imágenes de citometría de flujo y transcriptómicos perfiles (RNA-seq) para determinar localización subcelular alterado del grupo de proteínas de 1d de diferenciación (CD1d) asociado con expresión génica endocíticas deteriorada en humanos las células dendríticas (DCs), que fueron expuestas a la común lipofílico aire agente contaminador benzo [a] pireno. La colocalización de CD1d y proteínas endocíticas marcador Lamp1 de miles de imágenes celular con citometría de flujo de imagen fue analizada usando IDEAS y ImageJ-Fiji programas. Numerosas imágenes de celulares con proteínas Co teñidas de CD1d y Lamp1 fueron visualizados después de bloquear el CD1d+Lamp1+ DCs con IDEAS. La colocalización CD1d y Lamp1 mejorada sobre BaP exposición quedó demostrada además con thresholded diagramas de dispersión, probado con coeficientes de Mander de intensidad Co localizada y trazado basado en el porcentaje de áreas Co localizadas con ImageJ-Fiji. Nuestros datos proporcionan un enfoque instrumental y bioinformáticas ventajoso para medir la colocalización de proteínas a nivel celular individual y poblacional, apoyar un resultado funcional deterioro de transcriptómicos alteración en humanos expuestos a contaminantes DCs.
Introduction
Presentación del antígeno implica típicamente la proteína intracelular trata de personas, que se ha investigado a menudo mediante caracterización morfológica y fenotípica mediante perfiles del antígeno que presenta las células1,2,3 . Para integrar las ventajas de la proyección de imagen y métodos phenotyping, describimos una plataforma de análisis imágenes a nivel de la población para demostrar una colocalización de proteínas alteradas en células dendríticas humanas (DCs) y unicelular. En la presentación del antígeno del peptide, complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase I moléculas un péptido corto (8-10 residuos) se unen en el retículo endoplásmico para activar convencional CD8 células+ T, mientras que las moléculas de MHC clase II unen un relativamente largo péptido (~ 20 residuos) en compartimentos endocíticos activar convencionales CD4+ T las células1,4. Por el contrario, lípidos específicos de células T son activadas por proteínas CD1 con antígenos de lípidos cargados principalmente en compartimentos endocíticos5,6. Presentación del antígeno lípido requiere el suministro de metabolitos de lípidos producidos en lípidos metabolismo7,8,9,10 y la carga de metabolitos de lípidos funcionales a las proteínas CD1 en compartimentos endocíticos5,6. En este contexto, varios factores celulares modulando la presentación del antígeno lipídico, especialmente en la exposición ambiental de contaminantes lipofílicos y trastornos del sistema inmune, son críticos para definir. En este estudio, se utilizan análisis transcriptómico, perfiles de imagen y análisis de imagen celular y poblacional de DCs derivados de monocitos humanos para determinar el tráfico de proteínas endocíticas que contribuyen a la presentación del antígeno lípido en la exposición de contaminantes. Ciertamente, esta plataforma combinada puede aplicarse al estudio de tráfico de proteínas subcelulares y colocalización en diferentes procesos biológicos.
Técnicamente, la localización subcelular de la proteína fue demostrada generalmente usando microscopia confocal y analizados estadísticamente en un número limitado de células detectado1,2,3,11. Por otra parte, citometría de flujo ha sido ampliamente aplicada a poblaciones de la célula de la puerta con señales Co teñidas de múltiples proteínas en un nivel celular12; sin embargo, esto carece de una visualización detallada de colocalización de proteínas subcelulares. Para lograr el análisis integrales y estadísticos de porcentaje colocalización de proteínas a nivel celular y población, incorporamos enfoques de perfiles y análisis para determinar las características de la colocalización de la proteína con biológicos la proyección de imagen relevancia. Específicamente, utilizamos proyección de imagen de citometría de flujo para detectar la colocalización de CD1d y proteína de la membrana lisosomal asociada 1 (Lamp1) proteínas en este estudio. Análisis cuantitativo de moléculas colocalized era previamente difícil de realizarse a escala poblacional. En este estudio, adaptó el programa ImageJ-Fiji examinar el porcentaje de colocalización de proteínas con un gran número de células Co nivel celular tanto poblacional como individual. En concreto, hemos medido áreas Co localizadas, intensidad y tamaño poblacional para apoyar la conclusión de que la proteína de CD1d en gran parte se mantuvo en compartimentos endocíticos finales de humanos DCs en la exposición a un contaminante lipofílico benzo [a] pireno (BaP)13 . Este combinado celular y población de análisis proporcionan resultados altamente reproducibles, integrales y estadísticamente significativos de CD1d-Lamp1 colocalización correspondiente a la presentación del antígeno lípido inhibido.
El transcriptoma de DCs humanos expuestos al BaP apoya firmemente la hipótesis de que lípidos endocíticas y CD1d endocíticas tráfico fueron deterioradas en exposición de BaP. Para probar esta hipótesis, aplicamos imagen flujo cytometry Profile a las imágenes de la población de DC que co fueron manchadas con múltiples proteínas incluyendo CD1d, marcadores endocíticos y DC. Por último, co células se analizaron estadísticamente para demostrar el porcentaje de intensidad y zonas de CD1d y Lamp1 colocalización.
Protocol
Representative Results
Discussion
Funcional confirmación de un camino del gene alterado es un reto, debido a la expresión de genes ampliamente afectado con múltiples vías y la dificultad para integrar actividades celulares individuales y poblacionales. Empleamos imágenes flujo cytometry específicamente prueba CD1d trata de compartimentos endocíticos. Citometría de flujo de imágenes integra la medición poblacional de las células y la demostración individual de colocalización subcelular de proteínas múltiples. La microscopia confocal ha prop…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Roberto Giulitto (centro de sangre de centro) para las muestras de sangre humana y Lee Dr. Liang Niu para la normalización de la expresión génica. También agradecemos a Beca apoyo del nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (ES006096), centro ambiental genética (CEG) un proyecto piloto (S.H.), Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (AI115358) (S.H.), Universidad de Premio del Consejo de investigación de la Universidad de Cincinnati (S.H.) y Universidad de Cincinnati College de medicina mejora financiación básica (X. Z.).
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
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