המשלבים Cytometry זרימה הדמיה Transcriptomic פרופיל כדי להעריך שינו CD1d Endocytic סחר
Summary
הדמיה cytometry זרימה מספקת גישה אידיאלי כדי לזהות את שינוי מורפולוגי ופונקציונליים של תאים ברמות הפרט והן populational. הפונקציה endocytic שיבשו למצגת אנטיגן השומנים ב החשופים מזהם את האדם תאים דנדריטים הודגם עם transcriptomic בשילוב פרופיל של ביטוי גנים, הפגנה מורפולוגי של חלבון סחר בבני אדם.
Abstract
ניתוח populational של שינוי מורפולוגי ופונקציונליים של חלבונים endocytic הם מאתגרים עקב הדרישה של לכידת תמונה-ניתוח תמונה ברמה וסטטיסטיים תא בודד ברמה populational. כדי להתגבר על הקושי הזה, השתמשנו הדמיה cytometry זרימה, transcriptomic פרופיל (RNA-seq) כדי לקבוע שונה לוקליזציה subcellular של האשכול של בידול 1d חלבון (CD1d) הקשורים עם ביטוי גנים endocytic לקוי-אנוש תאים דנדריטים (Dc), אשר נחשפו המשותף lipophilic אוויר מזהם benzo pyrene [א]. Colocalization של CD1d וחלבונים סמן endocytic Lamp1 מתוך אלפי תמונות תא שנתפסו עם הדמיה cytometry זרימה נותחו באמצעות רעיונות ו- ImageJ-פיג’י תוכניות. תמונות הסלולר רבים עם שותף מוכתם חלבונים CD1d ו Lamp1 היו דמיינו לאחר gating על CD1d+Lamp1+ DCs באמצעות רעיונות. Colocalization CD1d ו Lamp1 משופרת על BaP חשיפה נוספת הדגימו באמצעות thresholded scatterplots, נבדק עם המקדמים של Mander עבור עוצמת משותפת לשפות אחרות, המותווה מבוסס על האחוז של אזורי משותף לשפות אחרות באמצעות ImageJ-פיג’י. הנתונים שלנו לספק גישה פלייבקים, bioinformatic יתרון למדוד חלבון colocalization ברמות יחיד והן populational הסלולר, תומך תוצאה מליקוי תפקודי של שינוי transcriptomic של האדם חשוף מזהמים בקרי קבוצת מחשבים.
Introduction
אנטיגן המצגת כוללת בדרך כלל חלבונים תאיים סחר, אשר לעיתים קרובות נחקר באמצעות אפיון מורפולוגי, יצירת פרופילים פנוטיפי של אנטיגן הצגת תאים1,2,3 . כדי לשלב את היתרונות של דימות ופעולות phenotyping, נתאר פלטפורמה ניתוח ההדמיה על תא בודד והן רמות האוכלוסיה להפגין colocalization שינו חלבון בתאים דנדריטים אנושי (Dc). במצגת אנטיגן פפטיד, הגדולות histocompatibility מורכבים (MHC) מחלקה אני מולקולות לאגד פפטיד קצר (8-10 שאריות) ב רשתית תוך-פלזמית כדי להפעיל CD8 קונבנציונלי+ T תאים, בעוד MHC class II מולקולות לאגד ארוך יחסית של פפטיד (שאריות ~ 20) בתאים endocytic להפעלת CD4 קונבנציונלי+ T תאים1,4. לעומת זאת, תאי T ספציפי השומנים מופעלים על ידי CD1 חלבונים עם אנטיגנים השומנים נטען בעיקר בתוך תאי endocytic5,6. מצגת אנטיגן השומנים דורש את האספקה של השומנים המטבוליטים המיוצר השומנים חילוף החומרים7,8,9,10 ו הטעינה של השומנים פונקציונלי מטבוליטים CD1 חלבונים ב- תאים endocytic5,6. בהקשר זה, גורמים שונים הסלולר להתכוונן המצגת אנטיגן השומנים, במיוחד, החשיפה הסביבתית של מזהמים lipophilic, כשל חיסוני, הם קריטיים כדי להיות מוגדר. במחקר זה, השתמשנו transcriptomic ניתוח תמונת פרופיל, תאית populational הדמיה וניתוח של האדם נגזר מונוציט DCs לקביעת חלבון endocytic הסחר תורם למצגת אנטיגן השומנים בחשיפה מזהמים. בהחלט, ניתן להחיל פלטפורמה משולבת זו ללמוד חלבון subcellular סחר, colocalization בתהליכים ביולוגיים שונים.
טכנית, לוקליזציה חלבון subcellular הודגם בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתח סטטיסטית במספר מוגבל של תאים שזוהו1,2,3,11. יתר על כן, cytometry זרימה בהרחבה הוחלה על שער תא אוכלוסיות עם אותות מוכתם משותפת של מספר חלבונים הסלולר ברמה12; עם זאת, זה חסרה ויזואליזציה מפורטת של חלבון subcellular colocalization. כדי להשיג ניתוחים סטטיסטיים ומקיף של אחוז חלבון colocalization ברמות הסלולר והן באוכלוסייה, אנו משלבים את הדמיה תיעוד וניתוח גישות כדי לקבוע את התכונות של חלבון colocalization עם ביולוגית רלוונטיות. באופן ספציפי, אנו משתמשים מיכשור הדמיה כדי לזהות את colocalization של CD1d ו חלבון ממברנלי lysosomal-הקשורים 1 (Lamp1) חלבונים במחקר זה. ניתוח כמותי של מולקולות colocalized היה בעבר קשה לביצוע בקנה מידה populational. במחקר זה, שינינו את התוכנית ImageJ-פיג’י לבחון את אחוז חלבון colocalization עם מספר גדול של תאים שותף מוכתם ברמה התאית הן populational והן בודדים. באופן ספציפי, מדדנו אזורי משותף לשפות אחרות, העוצמה וגודל populational כדי לתמוך במסקנה כי החלבון CD1d נשמר בעיקר בתאים endocytic מאוחר של בקרי תחום אנושי חשיפה benzo מזהם lipophilic [א] pyrene (BaP)13 . זה המשולבים סלולארי והאוכלוסיה הדמיה ניתוח סיפק תוצאות מאוד לשחזור מקיף, סטטיסטית CD1d-Lamp1 colocalization הרלוונטי למצגת אנטיגן השומנים עכבות.
Transcriptome החשופים BaP בדרור האנושי נתמך בחוזקה את ההשערה כי endocytic מטבולי וסחר CD1d endocytic היו ליקויי BaP בחשיפה. כדי לבדוק השערה זו, אנחנו מוחלים מיכשור הדמיה לפרופיל תמונות מאוכלוסיית DC משותפת היו מוכתמים חלבונים מרובים כולל CD1d endocytic סמנים, סמנים DC. לבסוף, תאים שותף מוכתם נותחו סטטיסטית כדי להדגים את האחוז של עוצמת ותחומי CD1d ו Lamp1 colocalization.
Protocol
Representative Results
Discussion
אישור פונקציונלי נתיב הגנים שינו הוא מאתגר, בגלל התבטאות גנים מושפעים נרחב המערבות מספר מסלולים ואת הקושי לשלב בודדים ופעילויות הסלולר populational. אנחנו מועסקים מיכשור הדמיה במיוחד במבחן CD1d סחר בתאים endocytic. הדמיה cytometry זרימה משלבת את המדידה populational של תאים ההפגנה בודדים של colocalization subcellular של מס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים, רוברט Giulitto (Hoxworth דם מרכז) תודה דגימות דם אדם וקורא ד ר Niu ליאנג על נירמול של ביטוי גנים. אנו מודים גם מענק תמיכה מ נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה (ES006096), המרכז גנטיקה סביבתיים (CEG) הפרויקט טייס (תרגום), המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (AI115358) (תרגום), אוניברסיטת פרס המועצה למחקר של אוניברסיטת סינסינטי (תרגום), האוניברסיטה של סינסינטי המכללה של רפואה הליבה שיפור המימון (אקס Z.).
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
