Integrar a citometria de fluxo de imagem e Transcriptomic de criação de perfil para avaliar alterados CD1d endocítica tráfico
Summary
Citometria de fluxo de imagem fornece uma abordagem ideal para detectar a alteração morfológica e funcional das células em níveis individuais e populacionais. Função endocítica interrompida para apresentação de antigénios de lipídios em células dendríticas humanas expostas ao poluente foi demonstrada com um combinado transcriptomic perfis de expressão genética e morfológica demonstração do tráfico de proteína.
Abstract
Análises populacionais da alteração morfológica e funcional de proteínas endocítica são um desafio devido à demanda de captura de imagem em uma análise de imagem de nível e estatística única célula em um nível populacional. Para superar esta dificuldade, usamos imagens citometria de fluxo e transcriptomic (RNA-seq) de criação de perfil para determinar a Localização subcellular alterada do cluster da proteína de 1D de diferenciação (CD1d) associada com expressão gênica endocítica prejudicada em humanos células dendríticas (DCs), que foram expostas à comum lipofílico ar poluente benzo [a] pireno. O colocalization de CD1d e endocítica marcador Lamp1 proteínas de milhares de células imagens capturadas com imaging citometria de fluxo foi analisada usando ideias e ImageJ-Fiji programas. Numerosas imagens celulares com proteínas CD1d e Lamp1 co manchadas foram visualizadas após retenção na CD1d+Lamp1+ DCs usando ideias. O colocalization CD1d e Lamp1 reforçada em cima BaP exposição demonstrou-se ainda mais usando thresholded scatterplots, testado com coeficientes de Mander para intensidade co localizada e plotados com base na porcentagem de áreas co localizadas usando o ImageJ-Fiji. Nossos dados fornecem uma abordagem instrumental e bioinformatic vantajosa para medir colocalization de proteína em níveis celulares único e populacionais, apoiando um resultado funcional prejudicado de transcriptomic alteração em humanos expostos a poluentes DCs.
Introduction
Apresentação de antigénios normalmente envolve proteínas intracelulares tráfico, que tem sido investigada frequentemente usando a caracterização morfológica e Caracterização fenotípica das apresentadoras de antígenos de células1,2,3 . Para integrar as vantagens da imagem latente e métodos de fenotipagem, descrevemos uma plataforma de análise de imagem em nível de população para demonstrar uma colocalization de proteína alterada em células dendríticas (DCs) e unicelulares. Na apresentação de antigénios do peptide, complexo de histocompatibilidade (MHC) classe I moléculas vincular um peptídeo curto (resíduos de 8-10) no retículo endoplasmático para ativar o CD8 convencional+ T células, enquanto moléculas de MHC classe II vincular um relativamente mais peptídeo (~ 20 resíduos) em compartimentos endocítica para ativar convencional CD4 células de+ T1,4. Em contraste, as células T de lipídios específicos são ativadas por proteínas CD1 com antígenos lipídicos carregados principalmente em compartimentos endocítica5,6. Apresentação de antigénios de lipídios requer o fornecimento de lipídios metabolitos produzidos no metabolismo lipídico7,8,9,de10 e o carregamento de metabólitos de lipídios funcionais para CD1 proteínas em compartimentos endocítica5,6. Neste contexto, diversos fatores celulares modulando a apresentação de antigénios de lipídios, especialmente na exposição ambiental de poluentes lipofílicos e distúrbios imunológicos, são essenciais para ser definido. Neste estudo, usamos transcriptomic análise, imagem de perfil e análise de imagens celular e populacional de DCs derivados de monócitos humanos para determinar a proteína endocítica tráfico contribuindo para apresentação de antigénios de lipídios na exposição de poluentes. Certamente, esta plataforma combinada pode ser aplicada para estudar proteínas subcellular tráfico e colocalization em diferentes processos biológicos.
Tecnicamente, a Localização subcellular da proteína geralmente foi demonstrada usando microscopia confocal e analisados estatisticamente em um número limitado de células detectado1,2,3,11. Além disso, citometria de fluxo tem sido amplamente aplicada a populações de células de portão com sinais co manchadas de múltiplas proteínas em um nível celular12; no entanto, este não possui uma visualização detalhada de colocalization Subcellular da proteína. Para realizar análises abrangentes e estatísticas de colocalization de proteína percentagem a nível celular e população, podemos incorporar imagens de perfis e análise de abordagens para determinar as características de colocalization de proteína com biológico relevância. Especificamente, nós usamos a citometria de fluxo de imagem para detectar o colocalization de CD1d e proteína de membrana lisossomal-associado 1 (Lamp1) proteínas neste estudo. Análise quantitativa de moléculas colocalized anteriormente era difícil a ser realizada em escala populacional. Neste estudo, adaptamos o programa ImageJ-Fiji para examinar a porcentagem de colocalization de proteína com um grande número de células coradas co nível populacional e individual celular. Especificamente, Nós medimos áreas co localizadas, intensidade e tamanho populacional para apoiar a conclusão de que a proteína CD1d em grande parte foi mantida em compartimentos endocítica atrasados do DCs humanas em exposição a um poluente lipofílicos benzo [a] pireno (BaP),13 . Este celular combinada e população de análise de imagem fornecidos resultados altamente reprodutíveis, abrangentes e estatisticamente significativos de CD1d-Lamp1 colocalization relevante para a apresentação de antigénios de lipídios inibida.
A transcriptoma do BaP-expostos DCs humanos fortemente apoiado a hipótese de que o metabolismo lipídico endocítica e CD1d endocítica tráfico foram prejudicadas em exposição BaP. Para testar esta hipótese, nós aplicamos a citometria de fluxo de imagem para o perfil de imagens da população de DC que co estavam manchadas com várias proteínas, incluindo CD1d, marcadores endocítica e marcadores de DC. Finalmente, as células co manchadas foram analisadas estatisticamente para demonstrar o percentual de intensidade e áreas de colocalization CD1d e Lamp1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Confirmação funcional do percurso gene alterado é um desafio, por causa da expressão do gene amplamente impactados envolvendo múltiplos caminhos e a dificuldade de integrar a actividade celular individual e populacional. Utilizamos a citometria de fluxo da imagem latente para especificamente teste CD1d tráfico de compartimentos endocítica. Citometria de fluxo de imagem integra a medição populacional das células e a demonstração individual da subcellular colocalization de várias proteínas. Microscopia confoc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Robert Giulitto (centro de sangue de Hoxworth) para amostras de sangue humano e Dr. Liang Niu para a normalização da expressão do gene lê. Agradecemos também a concessão de apoio do nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (ES006096), centro de genética ambiental (CEG) projecto-piloto (S.H.), Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (AI115358) (Samba), Universidade de Prêmio de Cincinnati University Research Council (S.H.) e Universidade de Cincinnati College de medicina núcleo realce do financiamento (X. Z.).
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
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