통합 이미징 Cytometry Transcriptomic 변경된 Endocytic CD1d 매매 평가 하 프로 파일링
Summary
Cytometry 이미징 개인과 populational 수준에서 세포의 형태학 적 및 기능적 변경 감지 하는 이상적인 접근을 제공 합니다. 오염 물질에 노출 된 인간의 수지상 세포에 지질 항 원 프레 젠 테이 션에 대 한 방해 endocytic 기능 유전자 발현 및 단백질 매매의 형태학 데모의 프로 파일링 결합된 transcriptomic 시연 했다.
Abstract
Endocytic 단백질의 형태 및 기능 변경의 populational 분석은 이미지 캡처 populational 수준에서 단일 셀 수준 및 통계 이미지 분석에서의 수요로 인해 도전. 이 어려움을 극복 하기 위해 우리 사용 이미징 cytometry transcriptomic (RNA-seq)를 프로 파일링 관련 차별화 1 d 단백질 (CD1d)의 클러스터의 변경 된 subcellular 지역화가 결정을 인간에서 손상된 endocytic 유전자 발현과 닥터지 일반에 노출 된 수지상 세포 (DCs), 공기 오염 물질 benzo pyrene [a]. CD1d 셀 이미지 이미징 cytometry 점령의 수천에서 endocytic 마커 Lamp1 단백질의 colocalization 아이디어와 ImageJ 피지를 사용 하 여 분석 프로그램. CD1d에 게이팅 후 공동 스테인드 CD1d 및 Lamp1 단백질 많은 세포 이미지 시각화 했다+Lamp1+ Dc 아이디어를 사용 하 여. BaP 노출 했다 Mander의 계수 공동 지역화 된 강도를 테스트 하 고 플롯 thresholded scatterplots를 사용 하 여 입증 시 향상 된 CD1d 및 Lamp1 colocalization ImageJ 피지를 사용 하 여 공동 화 된 영역의 비율 기반으로 합니다. 우리의 데이터 오염 물질에 노출 된 인간의 transcriptomic 변경의 장애인된 기능 결과 지 원하는 단일 및 populational 세포 수준에서 단백질 colocalization를 측정 하는 유리 기 악 및 bioinformatic 접근 방식을 제공합니다 Dc입니다.
Introduction
프레 젠 테이 션 항 원 일반적으로 자주 조사 형태학 상 특성 및 phenotypic 항 원 제시 세포1,2,3의 프로 파일링을 사용 하 여, 세포내 단백질을 포함 . 이미징 및 형질 방법의 장점을 통합 하는 이미징 분석 플랫폼 단일 세포 및 인간 모 수석 세포 (DCs)에서 변경 된 단백질 colocalization를 보여 인구 수준에서 설명 합니다. 펩 티 드 항 원 프레 젠 테이 션에서 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 종류 I 분자 활성화 기존의 CD8 바인딩과 그물에 짧은 펩 티 드 (8-10 잔류물)을 바인딩할+ T 세포, MHC 종류 II 분자 바인딩 상대적으로 더 오래 동안 기존의 CD4 활성화 endocytic 구획에 있는 펩 티 드 (~ 20 잔류물)+ T 세포1,4. 반면, 지질 관련 T 세포 지질 항 원 endocytic 구획5,6에 주로 로드와 CD1 단백질에 의해 활성화 됩니다. 지질 항 원 프레 젠 테이 션에서 지질 물질 대사7,8,,910 와 로드에 CD1 단백질 기능 지질 대사 산물의 생산 지질 대사 산물의 공급 필요 endocytic 구획5,6. 이러한 맥락에서 변조 지질 항 원 프레 젠 테이 션, 질 성 오염 물질 및 면역 장애, 환경 노출에서 특히 다양 한 세포 요소는 정의할 수 중요 합니다. 이 연구에서 우리가 사용 transcriptomic 분석, 이미지 프로 파일링, 인간 monocyte 파생 된 Dc의 셀룰러 및 populational 이미징 분석 endocytic 단백질 오염 물질 노출에 지질 항 원 프레 젠 테이 션에 기여 매매 결정 하. 물론,이 결합 된 플랫폼 subcellular 단백질 매매 및 다른 생물학 과정에 colocalization를 공부 하 고 적용할 수 있습니다.
기술적으로, 단백질 subcellular 지 방화는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 검색된 셀1,2,,311의 한정된 된 수에서 분석과 통계를 시연 일반적으로 했다. 또한, cytometry 광범위에 적용 된 세포 레벨12;에 여러 단백질의 공동 스테인드 신호 게이트 세포 인구 그러나,이 상세한 시각화 subcellular 단백질 colocalization의 부족. 휴대 및 인구 수준 비율 단백질 colocalization의 포괄적이 고 통계 분석을 달성 하기 위해 우리 이미징 생물학과 단백질 colocalization의 기능을 확인 하려면 프로 파일링 및 분석 접근 통합 관련성입니다. 특히, 우리를 사용 하 여 이미징 cytometry CD1d lysosomal 관련 막 단백질 1 (Lamp1)의 colocalization를 검출이 연구에서 단백질. Colocalized 분자의 정량 분석 populational 규모에서 이전 어려웠다. 이 연구에서 우리는 populational 및 개별 세포 수준에서 공동 스테인드 세포 수가 많은 단백질 colocalization의 비율을 조사 ImageJ 피지 프로그램 적응. 특히, 강도, 공동 화 된 지역과 CD1d 단백질 질 성 오염 물질 benzo [a] pyrene (BaP)13에 노출에 인간의 Dc의 늦은 endocytic 구획에 크게 유지 했다 결론을 지원 하기 위해 populational 크기 측정 . 이 결합 된 셀룰러 및 인구 분석 이미징 CD1d-Lamp1 colocalization 저해 지질 항 원 프레 젠 테이 션 관련의 높은 재현성, 포괄적인, 통계적으로 유의 한 결과 제공 합니다.
BaP에 노출 된 인간의 Dc transcriptome 강하게 endocytic 지질 대사 및 CD1d endocytic 밀매 BaP 노출에서 손상 했다 가설을 지원. 이 가설을 테스트 하기 위해 우리는 CD1d, endocytic 마커 및 DC 마커 포함 하는 여러 단백질으로 얼룩진 공동 했다 DC 인구의 이미지를 프로 파일링 하려면 이미징 cytometry 적용. 마지막으로, 공동 스테인드 셀 강도의 비율 및 CD1d 및 Lamp1 colocalization의 영역을 통계적으로 분석 되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
변경 된 유전자 통로의 기능 확인 널리 영향 을된 유전자 발현 포함 여러 통로 개인과 populational 세포 활동을 통합 하는 데 어려움 때문에 도전적 이다. 우리는 특별히 테스트 CD1d endocytic 구획에 인신 매매를 이미징 cytometry 고용. Cytometry 이미징 셀의 populational 측정 및 여러 단백질의 subcellular colocalization의 개별 데모 통합 합니다. Confocal 현미경 검사 법은 이전 단백질 colocalization를 측정에 높은 해상?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 인간의 혈액 샘플에 대 한 로버트 Giulitto (Hoxworth 혈액 센터) 감사 및 유전자 발현의 정규화에 대 한 박사 Liang Niu 읽습니다. 우리는 또한 보조금 지원에서 국립 연구소의 환경 건강 과학 (ES006096) 감사, 환경 유전학 (CEG) 파일럿 프로젝트 (상훈), 알레르기 국립 연구소와 전염병 (AI115358)를 위한 센터 (상훈)의 대학 신시내티 대학 연구 위원회 포상 (상훈), 그리고 대학의 신시내티 대학의 약 코어 향상 자금 (X. Z.).
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
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