Integreren van Imaging Stroom Cytometry en profilering te evalueren veranderde endocytotische CD1d handel Transcriptomic
Summary
Stroom cytometry Imaging biedt een ideale aanpak voor het detecteren van de morfologische en functionele wijziging van cellen op individuele en populational niveau. Verstoorde endocytotische functie voor lipide antigeen presentatie in verontreinigende stoffen blootgesteld menselijke dendritische cellen werd aangetoond met een gecombineerde transcriptomic profilering van genexpressie en morfologische demonstratie van eiwit mensenhandel.
Abstract
Populational analyses van de morfologische en functionele wijziging van endocytotische eiwitten zijn uitdagend vanwege de vraag van Fotolader op een eencellige niveau en statistische beeldanalyse op een populational niveau. Om deze moeilijkheid te overwinnen, we gewend imaging stroom cytometry en transcriptomic (RNA-seq) profilering bepalen veranderde subcellular localisatie van het cluster van differentiatie 1d eiwit (CD1d) die zijn gekoppeld met verminderde endocytotische genexpressie in mens dendritische cellen (DC’s), die werden blootgesteld aan de lipofiele common air pollutant benzo [a] pyreen. De colocalization van CD1d en endocytotische marker Lamp1 eiwitten uit duizenden cel beelden met imaging stroom cytometry werd geanalyseerd met behulp van ideeën en ImageJ-Fiji programma’s. Talrijke cellulaire beelden met mede gekleurd CD1d en Lamp1 eiwitten waren gevisualiseerd na gating op CD1d+Lamp1+ DCs met behulp van ideeën. De verbeterde CD1d en Lamp1 colocalization bij BaP blootstelling werd verder aangetoond met behulp van thresholded scatterplots, getest met Mander de coëfficiënten voor co gelokaliseerde intensiteit, en uitgezet op basis van het percentage van de medefinanciering gelokaliseerde gebieden met behulp van ImageJ-Fiji. Onze gegevens geven een voordelige instrumentaal en bioinformatic aanpak voor het meten van eiwit colocalization zowel één als populational cellulaire niveau, ter ondersteuning van een verminderde functionele uitkomst van transcriptomic wijziging in verontreinigende stoffen blootgesteld mens DCs.
Introduction
Antigeen presentatie omvat normaliter intracellulaire eiwitten mensenhandel, die is vaak onderzocht met behulp van morfologische karakterisering en fenotypische profilering van antigeen presentatie van cellen1,2,3 . Om de voordelen van beeldvorming en fenotypering methoden te integreren, beschrijven we een imaging platform van de analyse op zowel eencellige als populatie aan te tonen een veranderd eiwit colocalization in menselijke dendritische cellen (DC’s). In peptide-antigeen presentatie, grote histocompatibility complex (MHC) klasse I moleculen binden een korte peptide (8-10 residuen) in het endoplasmatisch reticulum te activeren van conventionele CD8+ T cellen, terwijl de MHC klasse II moleculen binden een relatief langere peptide (~ 20 residuen) in endocytotische compartimenten te activeren van conventionele CD4+ T cellen1,4. In tegenstelling, worden lipide-specifieke T-cellen geactiveerd door CD1 eiwitten met lipide antigenen geladen voornamelijk in endocytotische compartimenten5,6. Lipide antigeen presentatie bepaalt de levering van lipide metabolieten geproduceerd in8,9,10 , lipide metabolisme7,en het laden van functionele lipide metabolieten voor CD1 eiwitten in endocytotische compartimenten5,6. In dit verband zijn verschillende cellulaire factoren moduleren van lipide antigeen presentatie, met name in de milieublootstelling van lipofiele verontreinigende stoffen en immuun aandoeningen, cruciaal voor worden gedefinieerd. In deze studie, we gewend transcriptomic analyse, afbeelding profilering en cellulaire en populational imaging analyse van menselijke monocyt-afgeleide DCs bepalen de endocytotische eiwit mensenhandel bij te dragen aan lipide antigeen presentatie blootstelling van de verontreinigende stof. Zeker, dit gecombineerde platform kan worden toegepast op het bestuderen van eiwit subcellular mensenhandel en colocalization in verschillende biologische processen.
Eiwit subcellular localisatie bleek technisch, meestal met behulp van de confocal microscopie en statistisch geanalyseerd in een beperkt aantal gedetecteerde cellen1,,2,,3,11. Bovendien is cytometry van de stroom in grote lijnen toegepast op poort cel populaties met mede gebeitst signalen van meerdere eiwitten op een cellulair niveau12; echter, dit ontbreekt een gedetailleerde visualisatie van eiwit subcellular colocalization. Om uitgebreide en statistische analyses van percentage eiwit colocalization niveau van zowel de cellulaire en de bevolking, nemen we imaging profilering en analyse benaderingen om te bepalen van de kenmerken van eiwitten colocalization met biologische relevantie. Specifiek, we imaging stroom cytometry gebruiken voor het detecteren van de colocalization van CD1d en lysosomale-geassocieerde membraan eiwit 1 (Lamp1) eiwitten in deze studie. Kwantitatieve analyse van colocalized moleculen was eerder moeilijk op een populational schaal moet worden uitgevoerd. In deze studie aangepast we de ImageJ-Fiji-programma te onderzoeken het percentage eiwit colocalization met een groot aantal CO gekleurde cellen zowel populational als individuele cellulair niveau. Specifiek, we gemeten CO gelokaliseerde gebieden, intensiteit en populational grootte om de conclusie dat de CD1d proteïne was grotendeels bewaard in late endocytotische compartimenten van menselijke DCs blootstelling aan een lipofiele verontreinigende stof benzo [a] pyreen (BaP)13 te steunen . Deze gecombineerde cellulaire en bevolking imaging analyse zeer reproduceerbaar, uitgebreide en statistisch significante resultaten van CD1d-Lamp1 colocalization relevant zijn voor geremde lipide antigeen presentatie opgeleverd.
Transcriptome van BaP-blootgesteld menselijke DCs voorstander groot van de hypothese dat endocytotische lipide metabolisme en CD1d endocytotische handel in BaP blootstelling werden aangetast. Om te testen deze hypothese, pasten we imaging stroom cytometry om het profiel van de beelden van DC bevolking die samen met meerdere eiwitten met inbegrip van CD1d en endocytotische markeringen DC markeringen werden gekleurd. Ten slotte, mede gekleurde cellen zijn statistisch geanalyseerd om aan te tonen van het percentage van de intensiteit en gebieden van CD1d en Lamp1 colocalization.
Protocol
Representative Results
Discussion
Functionele bevestiging van een veranderd gen-traject is uitdagend, vanwege sterk beïnvloed genexpressie waarbij meerdere trajecten en de moeilijkheid om individuele en populational cellulaire activiteiten te integreren. Wij werkzaam imaging stroom cytometry specifiek test CD1d mensenhandel endocytotische compartimenten. Stroom cytometry Imaging integreert de populational meting van cellen en de afzonderlijke demonstratie van subcellular colocalization van meerdere eiwitten. Confocale microscopie heeft eerder verstrekte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Robert Giulitto (Hoxworth bloed midden) voor menselijke bloedmonsters en Dr. Liang Niu voor de normalisatie van de genexpressie leest. Wij danken ook financiële steun van de National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), centrum voor milieu genetica (CEG) proefproject (S.H.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (AI115358) (S.H.), Universiteit van Cincinnati University Research Council award (sh) en de Universiteit van Cincinnati College van geneeskunde Enhancement basisfinanciering (X. Z.).
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
