Intégrer la cytométrie en imagerie et transcriptomique profilage pour évaluer l’altération CD1d endocytose traite
Summary
Cytométrie en flux d’imagerie fournit une approche idéale pour détecter la modification morphologique et fonctionnelle des cellules aux niveaux individuel et populationnelles. Fonction d’endocytose perturbée pour présentation des antigènes lipidiques dans les cellules dendritiques humaines exposés à des polluants a été démontrée avec un combiné transcriptomique profilage de l’expression génique et démonstration morphologique de la protéine traite.
Abstract
Les analyses populationnelles de l’altération morphologique et fonctionnelle des protéines intervenant dans l’endocytose sont difficiles en raison de la demande de capture d’image à une analyse d’image plane et statistique unicellulaire à un niveau populationnelle. Pour surmonter cette difficulté, nous avons utilisé d’imagerie cytométrie et transcriptomique profilage (RNA-seq) pour déterminer la localisation sous-cellulaire altérée de l’amas de protéine de différenciation 1D (CD1d) associée à l’expression des gènes intervenant dans l’endocytose altérée chez l’homme les cellules dendritiques (CD), qui ont été exposés à la common liphophile air pollutant benzo [a] pyrène. La co-localisation de CD1d et protéines intervenant dans l’endocytose marqueur Lamp1 parmi des milliers de cellules images capturées avec écoulement cytometry d’imagerie a été analysée à l’aide d’idées et ImageJ-Fidji programmes. Nombreuses images cellulaires avec des protéines CD1d et Lamp1 co colorées ont été visualisées après blocage sur CD1d+Lamp1+ DCs idées. La co-localisation CD1d et Lamp1 améliorée sur BaP, l’exposition a été démontrée plus loin à l’aide de diagrammes de dispersion binariser, testé avec des coefficients de Mander pour co localisées d’intensité et tracés selon le pourcentage de zones co localisées à l’aide de ImageJ-Fidji. Nos données fournissent une approche instrumentale et bioinformatiques avantageuse pour mesurer la co-localisation de la protéine au niveau cellulaire unique et populationnelle, soutenant un résultat fonctionnel avec facultés affaiblies d’altération transcriptomique chez les humains exposés à des polluants Contrôleurs de domaine.
Introduction
Présentation de l’antigène implique en général des protéines intracellulaires traite, qui a été souvent étudié en utilisant la caractérisation morphologique et détermination des caractéristiques phénotypiques des antigène présentant des cellules1,2,3 . Pour intégrer les avantages de l’imagerie et les méthodes de phénotypage, nous décrivons une plate-forme d’analyse d’imagerie au niveau de la population à démontrer une colocalisation de protéine altérée dans les cellules dendritiques humaines (DCs) tant de cellule unique. Dans la présentation des antigènes peptidiques, complex majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I molécules lier un peptide court (8-10 résidus) dans le réticulum endoplasmique pour activer classiques CD8+ T des cellules, tandis que les molécules MHC classe II lient un relativement plus longue peptide (~ 20 résidus) dans des compartiments endocytose pour activer classiques CD4 des cellules de+ T1,4. En revanche, les lipides spécifiques T cellules sont activées par CD1 protéines avec des antigènes lipidiques chargés principalement dans des compartiments endocytose5,6. Présentation des antigènes lipidiques exige la fourniture des lipides métabolites produits en lipide métabolisme7,8,9,10 et le chargement des métabolites de lipides fonctionnels aux protéines CD1 endocytose compartiments5,6. Dans ce contexte, différents facteurs cellulaires modulant la présentation des antigènes lipidiques, en particulier dans l’exposition dans l’environnement des polluants lipophiles et désordres du système immunitaire, sont essentiels pour être défini. Dans cette étude, nous avons utilisé analyse transcriptomique, image profilage et analyse d’imagerie cellulaire et populationnelle de DCs de macrophages dérivés de monocytes humains afin de déterminer la protéine intervenant dans l’endocytose traite contribuant à la présentation des antigènes lipidiques à l’exposition à des polluants. Certes, cette plate-forme combinée peut être appliquée à l’étude traite des protéines subcellulaire et colocalisation dans différents processus biologiques.
Sur le plan technique, localisation subcellulaire de protéine a été démontrée généralement à l’aide de la microscopie confocale et statistiquement analysées dans un nombre limité de cellules détectées1,2,3,11. En outre, cytométrie en flux a été largement appliquée aux populations de cellules de porte avec des signaux de co teinté de plusieurs protéines à un niveau cellulaire12; Toutefois, cela n’a pas une visualisation détaillée de colocalisation de protéine subcellulaire. Pour réaliser des analyses complètes et statistiques de pourcentage colocalisation de protéine au niveau cellulaire et la population, nous incorporons imagerie approches de profilage et d’analyse afin de déterminer les caractéristiques de la co-localisation de protéine avec biologique pertinence. Plus précisément, nous utilisons cytométrie en flux d’imagerie pour détecter la co-localisation de CD1d et protéine 1 (Lamp1) de la membrane lysosomale associés aux protéines dans cette étude. Le dosage des molécules épididymaire était auparavant difficile à accomplir à l’échelle populationnelle. Dans cette étude, nous avons adapté le programme de ImageJ-Fidji à examiner le pourcentage de colocalisation de protéine avec un grand nombre de cellules co colorées au niveau cellulaire populationnelle tant individuels. Plus précisément, nous avons mesuré des zones localisées de co, intensité et la taille populationnelle pour étayer la conclusion que la protéine CD1d a été largement conservée dans des compartiments endocytose fin de DCs humaines dans une exposition à un polluant lipophiles de benzo [a] pyrène (BaP)13 . Ce combiné cellulaire et la population d’imagerie analyse a fourni des résultats hautement reproductibles, complets et statistiquement significatives de colocalisation CD1d-Lamp1 pertinente pour la présentation des antigènes lipidiques inhibé.
Le transcriptome de DCs humains exposés au BaP a fortement soutenu l’hypothèse que le métabolisme des lipides endocytose et CD1d endocytose trafic ont porté atteinte aux exposition BaP. Pour tester cette hypothèse, nous avons appliqué la cytométrie en flux d’imagerie pour profiler les images de population DC qui ont été colorées conjointement avec plusieurs protéines dont CD1d, endocytose marqueurs et DC. Enfin, les cellules colorées co analysés statistiquement pour illustrer le pourcentage d’intensité et de zones de colocalisation CD1d et Lamp1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Confirmation fonctionnelle d’une voie de gène est difficile, en raison de l’expression génique largement contaminé impliquant de multiples voies et la difficulté d’intégrer les activités cellulaires individuelles et populationnelles. Nous avons utilisé d’imagerie cytométrie à spécifiquement test CD1d traite des compartiments de l’endocytose. Cytométrie en flux d’imagerie intègre la mesure populationnelle des cellules et la démonstration individuelle de colocalisation subcellulaire des protéines …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Robert Giulitto (Centre de sang Hoxworth) pour les échantillons de sang humain et Dr Liang Niu pour la normalisation de l’expression génique lit. Nous remercions également les subventions de l’Institut National of Environmental Health Sciences (ES006096), Center for Environmental génétique (CEG) projetpilote (S.H.), Institut National des allergies et maladies infectieuses (AI115358) (S.H.), Université de Cincinnati University Research Council award (S.H.) et l’Université de Cincinnati College de médecine Enhancement financement de base (X. Z.).
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
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