Integrare la citometria a flusso di Imaging e trascrittomica profilatura per valutare alterata CD1d endocitico traffico
Summary
Citometria a flusso di imaging fornisce un approccio ideale per rilevare l’alterazione morfologica e funzionale delle cellule a livello individuale e popolazionale. Funzione endocitico interrotte per la presentazione dell’antigene del lipido in cellule dendritiche umane esposti a inquinanti è stata dimostrata con un’ Transcrittomica combinato del profilo di espressione genica e morfologiche dimostrazione di traffico della proteina.
Abstract
Popolazionale analisi dell’alterazione morfologica e funzionale delle proteine endocitiche sono difficili a causa della richiesta di acquisizione di immagini ad un’analisi di livello e Statistiche immagine singola cella a livello popolazionale. Per superare questa difficoltà, abbiamo usato imaging citometria a flusso e trascrittomica profilatura (RNA-seq) per determinare alterata localizzazione subcellulare del cluster di differenziazione 1d proteina (CD1d) connessa con l’espressione di gene endocitico compromessa in umani le cellule dendritiche (DCs), che sono stati esposti al comune lipofilico aria inquinante benzo pirene [a]. La colocalizzazione di CD1d e proteine endocitiche marker Lamp1 da migliaia di cellule immagini catturate con imaging citometria a flusso è stata analizzata utilizzando idee e ImageJ-Fiji programmi. Numerose immagini cellulare con co-macchiato CD1d e Lamp1 proteine sono state visualizzate dopo gating su CD1d+Lamp1+ DCs utilizzando idee. La colocalizzazione di CD1d e Lamp1 avanzata su BaP esposizione è stata ulteriormente dimostrata utilizzando con soglia scatterplot, testato con coefficienti di Mander per intensità co-localizzati e tracciati basato sulla percentuale di aree co-localizzate utilizzando ImageJ-Fiji. I nostri dati forniscono un approccio strumentale e bioinformatica vantaggioso per misurare la colocalizzazione di proteina a livello cellulare sia singolo che popolazionale, sostenendo un risultato funzionale alterato di trascrittomica alterazione in umani esposti a inquinanti Controller di dominio.
Introduction
Presentazione dell’antigene coinvolge tipicamente la proteina intracellulare di traffico, che è stato spesso studiata mediante caratterizzazione morfologica e profilatura fenotipica dell’antigene che presenta le cellule1,2,3 . Per integrare i vantaggi dell’imaging e metodi phenotyping, descriviamo una imaging piattaforma di analisi a livello di popolazione per dimostrare una colocalizzazione di proteina alterata in cellule dendritiche (DCs) e singola cella. Nella presentazione dell’antigene del peptide, complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I molecole legare un peptide breve (8-10 residui) nel reticolo endoplasmatico per attivare CD8 convenzionale+ T cellule, mentre le molecole di MHC classe II legano una relativamente più lungo peptide (~ 20 residui) in compartimenti endocitosi per attivare convenzionale CD4 cellule+ T1,4. Al contrario, le cellule T del lipido-specifiche vengono attivate dalle proteine CD1 con antigeni lipidici caricati principalmente in compartimenti endocitico5,6. Presentazione dell’antigene del lipido richiede la fornitura dei metaboliti lipidici prodotti nel metabolismo dei lipidi7,8,9,10 e il caricamento dei metaboliti lipidici funzionale alle proteine CD1 in compartimenti endocitico5,6. In questo contesto, vari fattori cellulari modulando la presentazione dell’antigene del lipido, specialmente in esposizione ambientale delle sostanze inquinanti lipofilici e disturbi del sistema immunitario, sono fondamentali per essere definito. In questo studio, abbiamo usato analisi trascrittomica, immagine di profilatura e analisi di imaging cellulare e popolazionali di DCs monocito-derivato umano per determinare il traffico di proteine endocitiche contribuendo alla presentazione dell’antigene del lipido in esposizione della sostanza inquinante. Certamente, questa piattaforma combinata può essere applicata a studiare traffico sottocellulare della proteina e la colocalizzazione in diversi processi biologici.
Tecnicamente, la localizzazione sottocellulare della proteina solitamente è stata dimostrata usando la microscopia confocal e analizzati statisticamente in un numero limitato di cellule rilevato1,2,3,11. Inoltre, citometria a flusso è stato ampiamente applicato a popolazioni di cellule di cancello con segnali co-macchiati delle proteine multiple a un livello cellulare12; Tuttavia, questo non dispone di una visualizzazione dettagliata di colocalizzazione subcellulare della proteina. Per ottenere analisi complete e statistiche di colocalizzazione di proteina percentuale a livello cellulare e popolazione, incorporiamo approcci di profilatura e di analisi per determinare le caratteristiche di colocalizzazione di proteina con biologico di imaging rilevanza. In particolare, utilizziamo imaging citometria a flusso per rilevare la colocalizzazione di CD1d e proteine di membrana lisosomiale-collegata 1 (Lamp1) proteine in questo studio. Analisi quantitativa delle molecole colocalized era precedentemente difficile da eseguirsi alla scala popolazionale. In questo studio, abbiamo adattato il programma ImageJ-Fiji per esaminare la percentuale di colocalizzazione di proteine con un gran numero di cellule co-marcate a livello cellulare sia popolazionale e individuali. In particolare, abbiamo misurato zone co-localizzate, intensità e dimensione popolazionale a sostegno della conclusione che la proteina CD1d in gran parte è stata conservata in compartimenti tardi endocitosi di DCs umano nell’esposizione a un inquinante lipofilico benzo [a] pirene (BaP)13 . Questa popolazione analisi di imaging e combinato cellulare fornito risultati altamente riproducibili, completi e statisticamente significative di CD1d-Lamp1 colocalizzazione pertinenti alla presentazione dell’antigene lipidica inibita.
Il trascrittoma di BaP-esposti umano DCs fortemente sostenuto l’ipotesi che il metabolismo lipidico endocitosi e CD1d endocitico traffico sono stati alterati in BaP esposizione. Per verificare questa ipotesi, abbiamo applicato imaging flusso cytometry per profilare le immagini della popolazione DC che co-sono state macchiate con più proteine tra cui CD1d, endocitosi marcatori e DC. Infine, le cellule co-macchiate sono state analizzate statisticamente per dimostrare la percentuale di intensità e aree di colocalizzazione CD1d e Lamp1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Conferma funzionale di una via di gene alterato è impegnativo, a causa di espressione genica ampiamente incastrato che coinvolgono le vie multiple e la difficoltà di integrare attività cellulari individuali e popolazionale. Abbiamo impiegato imaging flusso cytometry in particolare prova CD1d traffico endocitico scomparti. Citometria a flusso di imaging integra la misura popolazionale delle cellule e la dimostrazione individuo di colocalizzazione subcellulare delle proteine multiple. Microscopia confocale ha fornito pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Robert Giulitto (centro di sangue Hoxworth) per campioni di sangue umano e legge Dr. Liang Niu per la normalizzazione dell’espressione genica. Ringraziamo anche sovvenzioni dal National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Center for progetto pilota ambientale genetica (CEG) (S.H.), Istituto nazionale di allergie e malattie infettive (AI115358) (S.H.), Università di Cincinnati University Research Council award (S.H.) e Università di Cincinnati College di medicina Enhancement finanziamento di base (X. Z.).
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
