Integration von Imaging Durchflusszytometrie und transkriptomischen Profilierung zu veränderten Endocytic CD1d Handel bewerten
Summary
Durchflusszytometrie Imaging bietet einen idealen Ansatz um die morphologische und funktionelle Veränderung der Zellen auf individuelle und populational Ebene zu erkennen. Gestörten endocytic Funktion für Lipid Antigenpräsentation in Schadstoff-exponierten menschlichen dendritischen Zellen wurde mit einem kombinierten transkriptomischen Profilierung der Genexpression und morphologischen Demonstration des Handels mit Protein nachgewiesen.
Abstract
Populational Analysen der morphologischen und funktionellen Veränderung der endocytic Proteine sind aufgrund der Nachfrage der Bilderfassung in einer Einzelzelle Ebene und statistische Bildanalyse auf einem populational Niveau anspruchsvoll. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, zum wir bildgebende Durchflusszytometrie und transkriptomischen profiling (RNA-Seq) veränderten subzelluläre Lokalisation des Clusters Differenzierung 1D Protein (CD1d) verbundenen bestimmen mit eingeschränkter endocytic Genexpression in menschlichen Dendritische Zellen (DCs), die die gemeinsame lipophilen ausgesetzt wurden Luft Schadstoff Benzo [a] pyren. Die NS1 CD1d und endocytic Marker Lamp1-Proteine aus Tausenden von Zelle Bilder mit imaging-Durchflusszytometrie wurde mit Ideen und ImageJ-Fidschi analysiert Programme. Zahlreiche zelluläre Bilder mit Co gefärbten CD1d und Lamp1 Proteine wurden nach Anspritzung auf CD1d visualisiert+Lamp1+ DCs mit Ideen. Die verbesserte CD1d und Lamp1 NS1 auf BaP Exposition weiter demonstriert wurde, mit thresholded Scatterplots, getestet mit Mander des Koeffizienten für Co lokalisierte Intensität und geplottet basierend auf dem Prozentsatz von Co lokalisierten Bereichen mit ImageJ-Fidschi. Unsere Daten bieten einen vorteilhaften Instrumental- und bioinformatische Ansatz zur Messung von Protein NS1 auf Einzel- und populational zellulären Ebenen beeinträchtigtes funktionelle Ergebnis transkriptomischen Änderung in Schadstoff-exponierten Menschen unterstützen DCs.
Introduction
Antigenpräsentation umfasst in der Regel intrazelluläre Protein Menschenhandel, die oft mit Morphologische Charakterisierung und phänotypischen Profilierung der antigenpräsentierende Zellen1,2,3 untersucht wurden . Um die Vorteile der Bildgebung und Phänotypisierung Methoden zu integrieren, beschreiben wir eine bildgebende Analyseplattform auf Einzelzelle und Einwohnerzahlen zu einem veränderten Protein NS1 in menschlichen dendritischen Zellen (DCs) zeigen. Im Peptid Antigenpräsentation große Histocompatibility complex (MHC) Klasse I Moleküle binden eine kurze Peptid (8-10 Rückstände) in das endoplasmatische Retikulum konventionellen CD8 aktivieren+ T-Zellen, während MHC-Klasse-II-Moleküle relativ länger binden Peptid (~ 20 Rückstände) in endocytic Fächern für konventionelle CD4 aktivieren+ T Zellen1,4. Im Gegensatz dazu werden Lipid-spezifischen T-Zellen durch CD1 Proteine mit Lipid-Antigenen, die vor allem in endocytic Fächern5,6geladen aktiviert. Lipid Antigenpräsentation erfordert die Versorgung von Lipid-Metaboliten in Lipid Metabolismus7,8,9,10 und das Laden von funktionalen Lipid-Metaboliten auf CD1 Proteine in produziert endocytic Fächer5,6. In diesem Zusammenhang kritisieren verschiedene zelluläre Faktoren modulieren Lipid Antigenpräsentation, vor allem in Umweltexposition von lipophilen Schadstoffen und Erkrankungen des Immunsystems, definiert werden. In dieser Studie verwendeten wir transkriptomischen Analyse, Bild Profilierung und zellulären und populational bildgebende Analyse der menschlichen Monocyte abgeleitet DCs bestimmen das endocytic Protein Menschenhandel zur Lipid Antigenpräsentation in Schadstoff-Exposition. Natürlich kann diese kombinierte Plattform genutzt werden, um Studium der subzellulären Protein Menschenhandel und NS1 in verschiedenen biologischen Prozessen.
Technisch, zeigte Protein subzelluläre Lokalisation in der Regel mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie und statistisch analysiert in einer begrenzten Anzahl von gefundenen Zellen1,2,3,11. Darüber hinaus wurde Durchflusszytometrie weitgehend auf Tor Zell-Populationen mit Co gefärbten Signale von mehreren Proteinen auf einem zellularen Niveau12angewendet; Das fehlen jedoch einer detaillierte Visualisierung der subzellulären Protein NS1. Um umfassende und statistische Analysen der Prozentsatz Protein NS1 Ebene Mobilfunk und der Bevölkerung zu erreichen, integrieren wir imaging Profilierung und Analyse Ansätze bestimmen die Eigenschaften des Proteins NS1 mit biologischen Relevanz. Insbesondere verwenden wir bildgebende Durchflusszytometrie NS1 CD1d und lysosomale verbundenen Membranprotein 1 (Lamp1) erkennen Proteine in dieser Studie. Quantitative Analyse der colocalized Moleküle war bisher schwierig, in einem populational Maßstab durchgeführt werden. In dieser Studie haben wir die ImageJ-Fidschi-Programm, den Anteil an Protein NS1 mit einer großen Anzahl von Co gefärbten Zellen populational und einzelner zellulärer Ebene untersuchen angepasst. Insbesondere haben wir gemessen Co lokalisierten Bereichen, Intensität und populational Größe zu der Schlussfolgerung, dass das CD1d-Protein weitgehend in späten endocytic Abteilen des menschlichen DCs in Exposition gegenüber einem lipophilen Schadstoffen Benzo [a] pyren (BaP)13 beibehalten wurde . Diese kombinierte zelluläre und Bevölkerung bildgebende Analyse zur Verfügung gestellt hoch reproduzierbare, umfassende und statistisch signifikante Ergebnisse der CD1d-Lamp1 NS1 für gehemmt Lipid Antigenpräsentation relevant.
Das Transkriptom des BaP-exponierten menschlichen DCs unterstützt nachdrücklich die Hypothese, dass endocytic Lipidstoffwechsel und CD1d endocytic Menschenhandel in BaP-Exposition beeinträchtigt wurden. Um diese Hypothese zu testen, haben wir bildgebende Durchflusszytometrie um die Bilder der DC Bevölkerung Profil, die mit mehreren Proteinen einschließlich CD1d, endocytic Markierungen und DC-Marker Co gebeizt wurden angewandt. Schließlich wurden Co gefärbten Zellen statistisch analysiert, um den Prozentsatz der Intensität und Bereiche der CD1d und Lamp1 NS1 zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Funktionale Bestätigung über eine veränderte Gen Weg ist anspruchsvoll, wegen der stark belasteten Genexpression, an denen mehrere Wege und die Schwierigkeit, individuelle und populational Zellaktivitäten zu integrieren. Wir beschäftigten bildgebenden Durchflusszytometrie, speziell Test CD1d Handel in endocytic Fächern. Imaging Durchflusszytometrie integriert die populational Messung der Zellen und die individuelle Demonstration der subzellulären NS1 mehrere Proteine. Konfokale Mikroskopie hat zuvor hohen Auflösu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Robert Giulitto (Hoxworth Blutzentrale) für menschlichen Blutproben und Dr. Liang Niu für die Normalisierung der Genexpression liest. Wir danken auch Zuschüsse aus dem National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Zentrum für ökologische Genetik (CEG) Pilotprojekt (SH), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (AI115358) (s.h.), Universität Cincinnati University Research Council Award (SH) und Universität von Cincinnati College of Medizin Enhancement Grundfinanzierung (X. Z.).
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
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