دمج تصوير التدفق الخلوي والتنميط لتقييم الاتجار بتغيير CD1d اندوسيتيك ترانسكريبتوميك
Summary
ويوفر نهج مثالي للكشف عن تغيير الخصائص المورفولوجية والوظيفية للخلايا على الصعيدين الفردي وسكاني التصوير التدفق الخلوي. قد تجلى تعطل وظيفة اندوسيتيك لعرض مستضد الدهن في الخلايا الجذعية البشرية المعرضة للملوثات مع ترانسكريبتوميك مجتمعة التنميط التعبير الجيني ومظاهره المورفولوجية للاتجار بالبروتين.
Abstract
تحليل سكاني لتغيير الخصائص المورفولوجية والوظيفية للبروتينات اندوسيتيك صعبة بسبب الطلب على التقاط الصور في إجراء تحليل صورة الإحصائية ومستوى خلية واحدة على مستوى سكاني. وللتغلب على هذه الصعوبة، استخدمنا التصوير التدفق الخلوي وترانسكريبتوميك التنميط (الحمض النووي الريبي-seq) لتحديد تغيير التعريب سوبسيلولار بالمجموعة من التمايز د 1 البروتين (CD1d) المرتبطة بالتعبير الجيني اندوسيتيك البصر في الإنسان الخلايا الجذعية (DCs)، التي تتعرض للمشترك محبتين الهواء الملوثات بنزو [أ] بيرين. وقد تم تحليل كولوكاليزيشن CD1d والبروتينات علامة اندوسيتيك Lamp1 الآلاف من خلية الصور التي تم التقاطها مع التصوير التدفق الخلوي استخدام الأفكار وفيجي إيماجيج البرامج. كانت تصور العديد من الصور الخلوية مع البروتينات CD1d و Lamp1 شارك الملون بعد النابضة في CD1d+Lamp1+ وحدات تحكم المجال Dc باستخدام الأفكار. كولوكاليزاتيون CD1d و Lamp1 المعززة عند التعرض تجلى كذلك استخدام سكاتيربلوتس ثريشولديد، اختبار مع المعاملات في ماندر لكثافة مترجمة شارك، ودبر BaP استناداً إلى النسبة المئوية للمناطق شارك المترجمة باستخدام إيماجيج وفيجي. وتوفر البيانات لدينا نهج الآلي و bioinformatic مفيدة لقياس البروتين كولوكاليزاتيون على المستويات الخلوية كل واحد وسكاني، دعم البصر نتيجة وظيفية لتغيير ترانسكريبتوميك في الإنسان المعرضة للملوثات وحدات تحكم المجال Dc.
Introduction
مستضد العرض التقديمي عادة ما ينطوي على البروتين داخل الخلايا الاتجار بالأشخاص، التي قد تحقق غالباً استخدام توصيف الخصائص المورفولوجية والتنميط المظهرية من مستضد تقديم الخلايا1،2،3 . لدمج مزايا التصوير وأساليب فينوتيبينج، يصف لنا منصة تحليل تصوير في كل من خلية مفردة ومستويات السكان تبرهن كولوكاليزيشن تغيير بروتين في الخلايا الجذعية البشرية (DCs). في الببتيد مستضد العرض الرئيسية histocompatibility المعقد (MHC) الفئة الأولى جزيئات الربط ببتيد قصيرة (8-10 البقايا) في هيولى لتنشيط CD8 التقليدية+ تي الخلايا، بينما MHC class ثانيا جزيئات تربط أطول نسبيا الببتيد (بقايا ~ 20) في مقصورات اندوسيتيك لتنشيط خلايا CD4 التقليدية الخلايا+ ر1،4. على النقيض من ذلك، يتم تنشيط خلايا تي الخاصة بالدهن من البروتينات CD1 مع المستضدات الدهن تحميل أساسا في المقصورات اندوسيتيك5،6. يتطلب عرض مستضد الدهن المعروض من نواتج الأيض الدهون المنتجة في دهن الأيض7،،من89،10 والتحميل من نواتج الأيض الدهني الوظيفية للبروتينات CD1 في المقصورات اندوسيتيك5،6. وفي هذا السياق، مختلف العوامل الخلوية تحوير المادة الدهنية مستضد العرض، لا سيما في التعرض البيئي للملوثات محبتين والاضطرابات المناعية، أمرا حاسما لتعريفها. في هذه الدراسة، استخدمنا التحليل ترانسكريبتوميك وتنميط الصورة وتحليل التصوير الخلوية وسكاني للبشرية DCs المشتقة من الوحيدات لتحديد البروتين اندوسيتيك الاتجار بالمساهمة في عرض مستضد الدهن في التعرض للملوثات. بالتأكيد، يمكن تطبيق هذا المنهاج المشترك لدراسة الاتجار بالبروتين سوبسيلولار وكولوكاليزاتيون في مختلف العمليات البيولوجية.
من الناحية التقنية، تجلى التعريب سوبسيلولار البروتين عادة استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] وتحليلها إحصائيا في عدد محدود من الكشف عن الخلايا1،2،،من311. وعلاوة على ذلك، التدفق الخلوي طبق على نطاق واسع إلى بوابة الخلية السكان مع إشارات شارك الملون البروتينات متعددة على مستوى خلوي12؛ ولكن هذا يفتقر إلى وضع تصور مفصل للبروتين سوبسيلولار كولوكاليزيشن. لتحقيق تحليلات شاملة وإحصائية لنسبة البروتين كولوكاليزاتيون على المستويين الخلوي والسكان، ونحن إدراج التصوير نهج التنميط والتحليل لتحديد ملامح كولوكاليزاتيون البروتين مع البيولوجية أهمية. على وجه التحديد، يمكننا استخدام التصوير التدفق الخلوي للكشف عن كولوكاليزيشن CD1d وغشاء الليزوزومية المرتبطة بالبروتين 1 (Lamp1) البروتينات في هذه الدراسة. وكان التحليل الكمي لجزيئات كولوكاليزيد سابقا صعبة يجب القيام بها في نطاق سكاني. في هذه الدراسة، علينا تكييف البرنامج ImageJ-فيجي للنظر في النسبة المئوية للبروتين كولوكاليزاتيون مع عدد كبير من الخلايا الملون المشترك على المستويين الخلوي سكاني والفردية. على وجه التحديد، قمنا بقياس المجالات شارك المترجمة وكثافة وحجم سكاني تدعم الاستنتاج بأن البروتين CD1d أبقى إلى حد كبير في أواخر مقصورات اندوسيتيك للإنسان وحدات تحكم المجال Dc في التعرض الملوثات محبتين بنزو [أ] بيرين (BaP)13 . توفير هذا الخلوي مجتمعة والسكان التصوير تحليل النتائج استنساخه بدرجة عالية وشاملة ويعتد به إحصائيا من CD1d-Lamp1 كولوكاليزيشن ذات الصلة بالمادة الدهنية تحول دون مستضد العرض التقديمي.
الترنسكربيتوم Dc البشرية المعرضة BaP تؤيد بقوة الفرضية القائلة بأن الأيض الدهني اندوسيتيك والاتجار اندوسيتيك CD1d كانت ضعف في التعرض BaP. لاختبار هذه الفرضية، طبقنا التصوير التدفق الخلوي الشخصية صور سكان العاصمة التي كانت تشارك ملطخة بالبروتينات متعددة بما في ذلك العاصمة علامات وعلامات اندوسيتيك و CD1d. أخيرا، حللت إحصائيا الخلايا الملون المشترك لإظهار النسبة المئوية لكثافة ومناطق كولوكاليزيشن CD1d و Lamp1.
Protocol
Representative Results
Discussion
هو تحدي تأكيد طريقا المعدلة الجينات الوظيفية، بسبب الجينات أثرت على نطاق واسع التي تنطوي على مسارات متعددة، وصعوبة إدماج الأنشطة الخلوية الفردية وسكاني. استخدمنا التصوير التدفق الخلوي للتحديد اختبار CD1d الاتجار في المقصورات اندوسيتيك. التصوير التدفق الخلوي يدمج سكاني قياس الخلايا والمظ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون جوليتو روبرت (مركز الدم هوكسوورث) لعينات الدم البشري ويقرأ الدكتور ليانغ نيو لتطبيع التعبير الجيني. ونشكر أيضا دعم منحة من “معهد البيئة الصحية العلوم الوطنية” (ES006096)، ومركز لعلم الوراثة البيئية (CEG) مشروع تجريبي (أدمغة)، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (AI115358) (أدمغة)، جامعة منح “مجلس البحوث في جامعة سينسيناتي” (أدمغة)، وجامعة “سينسيناتي كلية للطب الأساسية تعزيز التمويل” (عاشرا ض.).
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
