Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini
Summary
Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), insan hastalığı ile güçlü bir humoral otoimmün yanıtı paylaşan bir multipl skleroz (MS) hayvan modelidir. Burada, EAE ile aşılanmış farelerin serumundaki otoantikorları ölçmek için basit ve esnek bir ELISA protokolü bildiriyoruz.
Abstract
Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), otoimmün hastalık multipl sklerozu (MS) histopatolojik ve moleküler düzeyde özetleyen bir hastalık modelidir. EAE, immün yanıtı artırmak için spesifik adjuvanlarla birlikte kısa miyelin peptitlerinin deri altı enjeksiyonu yoluyla deney hayvanlarının aşılanmasıyla indüklenir. İnsan muadili gibi, EAE fareleri de demiyelinizan lezyonlar, merkezi sinir sistemine (CNS) bağışıklık hücresi infiltrasyonu, glia aktivasyonu ve nöronal hasar geliştirir. Tutarlı bir kanıt grubu, hem MS hem de EAE’nin etiyolojisinde B hücre disfonksiyonu için mekanik bir rolü desteklemektedir. B hücreleri, antijen sunan hücrelerin yanı sıra birincil proinflamatuar sitokinler ve otoantikor kaynağı olarak da hizmet edebilir. EAE’de, hastalığı indüklemek için kullanılan miyelin peptitlerine karşı antikorlar üretilir. Bu tür otoantikorların, CNS’ye miyelin kaybına veya patojenik T hücresi reaktivasyonuna aracılık ettiği gösterilmiştir. Bu makale, miyelin oligodendrosit glikoprotein 35-55 (MOG35-55) peptidi ile aşılanmış C57BL/6J farelerinin serumundaki otoantikorları ölçmek için etkili bir ELISA tabanlı protokolü açıklamaktadır. Önerilen yöntem, otoimmün demiyelinizasyon bağlamında anormal humoral yanıtın özgüllüğünü ve büyüklüğünü araştırmak için güçlü bir araç olarak hizmet eder.
Introduction
Multipl skleroz (MS), immün hücrelerin beyin parankimine fokal infiltrasyonu, aksonları saran miyelin kılıflarının parçalanması, glia aktivasyonu ve nöronal kayıp ile karakterize merkezi sinir sisteminin (MSS) kronik otoimmün bir hastalığıdır1. Patojenik T hücrelerinin iyi bilinen rolüne ek olarak, çok sayıda kanıt, B hücrelerinin CNS’ye karşı otoimmün tepkiye aracılık etmede rol oynadığını vurgulamıştır. B hücreleri MS beyninde klonal genişlemeye uğrar ve demiyelinize lezyonlarda miyelin bileşenlerine karşı antikorlar tespit edilmiştir 2,3. Hastalık başlangıcında periferik B hücrelerinin seçici aktivasyonu yakın zamanda belgelenmiştir, bu da bu bağışıklık hücresi bölmesinin hastalığın başlangıcında da varsayılan bir rol oynadığını düşündürmektedir4. Anti-CD20 monoklonal antikorları gibi B hücresini tüketen tedavilerin başarısı, anormal B hücresi fonksiyonu ile otoimmün demiyelinizasyonarasındaki mekanik bağlantıyı daha da doğrulamaktadır 5,6. Moleküler açıdan bakıldığında, B hücreleri otoantijen sunumu, proinflamatuar sitokin sekresyonu ve otoreaktif antikor üretimi yoluyla hastalığa katkıda bulunabilir.
Karmaşık MS fenotipinin spesifik özelliklerini özetlemek için çoklu hayvan modelleri geliştirilmiştir. Bunlar arasında, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) en yaygın kullanılanıdır in vivo paradigma ve deney hayvanlarının miyelin oligodendrosit glikoproteini (MOG) ve miyelin bazik proteini (MBP) gibi miyelin proteinlerinden türetilen kısa peptitlerle aşılanmasına dayanır7. EAE ile aşılanmış hayvanlar, ensefalitojenik peptit8’e karşı sağlam bir humoral yanıt da dahil olmak üzere birçok yönden MS’e benzeyen demiyelinizan bir patoloji geliştirir. Bu nedenle, EAE çalışmaları, hastalık bağlamında B hücrelerinin ve otoantikorların fonksiyonunu incelemede etkili olmuştur. Örneğin, MS hastalarından izole edilen MOG’a özgü antikorların EAE modellerinde klinik seyri ağırlaştırabileceği gösterilmiştir9. Özellikle, insan MOG’unda 42. pozisyondaki prolin kalıntısının, otoantikor patojenitesini10 belirlemek için kritik olduğu gösterilmiştir. Daha yakın zamanlarda, MOG’a özgü otoantikorların sadece miyelin kaybına aracılık ederek değil, aynı zamanda CNS11 içindeki otoreaktif T hücrelerinin yeniden aktivasyonunu artırarak da hastalığı teşvik ettiği bulunmuştur.
CNS otoimmünitesinde antikor yanıtlarının önemi göz önüne alındığında, bu makale, MOG35-55 peptid ile aşılanmış C57BL / 6J farelerde otoreaktif antikorların serum seviyelerini etkili bir şekilde ölçmek için ELISA tabanlı bir protokol sunmaktadır. Protokolün ilk bölümünde, intrakardiyak ponksiyon yoluyla serum toplama yöntemi anlatılacaktır. Daha sonra, ELISA testini kurma ve verileri elde etme prosedürleri detaylandırılacaktır. Son olarak, veri analizi ve yorumlanması tartışılacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, MS patolojisinin ilgili bir hayvan modelinde humoral yanıtı doğru bir şekilde ölçmek için basit ve etkili bir ELISA tabanlı protokol bildirilmiştir. Bu yöntem, MOG35-55 / C57BL6J EAE paradigma12’deki otoantikorların serum seviyelerini kontrol etmede ataksin-1 proteininin yeni rolünü tanımlamak için yakın zamanda kullanılmıştır. Bu bağlamda, bu yöntemle tutarlı ve biyolojik olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için bir dizi faktör göz önünde bulundurulmalıdır.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R03NS131908) ve Savunma Bakanlığı tarafından W81XWH-22-1-0517 Ödül No’lu Multipl Skleroz Araştırma Programı aracılığıyla desteklenmiştir. Görüşler, yorumlar, sonuçlar ve tavsiyeler yazara aittir ve Savunma Bakanlığı tarafından onaylanması gerekmez. Bu çalışma aynı zamanda East Carolina Üniversitesi başlangıç fonları tarafından da desteklenmiştir.
Materials
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
- Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
- Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
- Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
- Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
- Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
- Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
- Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
- Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
- Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).
