Quantificazione degli anticorpi autoreattivi nei topi dopo encefalomielite autoimmune sperimentale
Summary
L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla (SM), che condivide con la malattia umana una robusta risposta autoimmune umorale. Qui, riportiamo un protocollo ELISA semplice e flessibile per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi immunizzati con EAE.
Abstract
L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello di malattia che ricapitola la malattia autoimmune della sclerosi multipla (SM) a livello istopatologico e molecolare. L’EAE è indotto dall’immunizzazione di animali da esperimento tramite iniezione sottocutanea di peptidi di mielina corta insieme a coadiuvanti specifici per aumentare la risposta immunitaria. Come la controparte umana, i topi EAE sviluppano lesioni demielinizzanti, infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC), attivazione della glia e danno neuronale. Un corpo coerente di prove supporta anche un ruolo meccanicistico per la disfunzione delle cellule B nell’eziologia sia della SM che dell’EAE. Le cellule B possono fungere da cellule presentanti l’antigene e da fonte primaria di citochine pro-infiammatorie e autoanticorpi. Nell’EAE, vengono generati anticorpi contro i peptidi mielinici che sono stati impiegati per indurre la malattia. È stato dimostrato che tali autoanticorpi mediano la perdita di mielina o la riattivazione delle cellule T patogene nel SNC. Questo articolo descrive un efficiente protocollo basato su ELISA per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi C57BL/6J immunizzati con il peptide della glicoproteina 35-55 degli oligodendrociti mielinici (MOG35-55). Il metodo proposto funge da potente strumento per studiare la specificità e l’entità della risposta umorale aberrante nel contesto della demielinizzazione autoimmune.
Introduction
La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune cronica del sistema nervoso centrale (SNC) caratterizzata da infiltrazione focale di cellule immunitarie nel parenchima cerebrale, rottura delle guaine mieliniche che avvolgono gli assoni, attivazione della glia e perdita neuronale1. Oltre al ruolo ben consolidato delle cellule T patogene, molteplici linee di evidenza hanno evidenziato il coinvolgimento delle cellule B nella mediazione della risposta autoimmune contro il SNC. Le cellule B subiscono un’espansione clonale nel cervello della SM e sono stati rilevati anticorpi contro i componenti della mielina all’interno delle lesioni demieliniche 2,3. L’attivazione selettiva delle cellule B periferiche all’esordio della malattia è stata recentemente documentata, suggerendo un ruolo putativo per questo compartimento immunitario anche nell’inizio della malattia4. Il successo delle terapie che depleiscono le cellule B come gli anticorpi monoclonali anti-CD20 corrobora ulteriormente la connessione meccanicistica tra il funzionamento aberrante delle cellule B e la demielinizzazione autoimmune 5,6. Da un punto di vista molecolare, le cellule B possono contribuire alla malattia attraverso la presentazione di autoantigeni, la secrezione di citochine pro-infiammatorie e la produzione di anticorpi autoreattivi.
Sono stati sviluppati diversi modelli animali per ricapitolare caratteristiche specifiche del fenotipo complesso della SM. Tra questi, l’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è il paradigma più utilizzato in vivo e si basa sull’immunizzazione di animali da esperimento con peptidi corti derivati da proteine mieliniche come la glicoproteina oligodendrocitaria mielina (MOG) e la proteina basica della mielina (MBP)7. Gli animali immunizzati con EAE sviluppano una patologia demielinizzante che assomiglia alla SM in molti aspetti, inclusa una robusta risposta umorale contro il peptide encefalitogeno8. Per questo motivo, gli studi EAE sono stati determinanti per sezionare la funzione delle cellule B e degli autoanticorpi nel contesto della malattia. Ad esempio, è stato dimostrato che gli anticorpi specifici per MOG isolati da pazienti con SM possono aggravare il decorso clinico nei modelli EAE9. In particolare, il residuo di prolina in posizione 42 nel MOG umano si è dimostrato fondamentale per determinare la patogenicità degli autoanticorpi10. Più recentemente, è stato scoperto che gli autoanticorpi specifici per MOG promuovono la malattia non solo mediando la perdita di mielina, ma anche aumentando la riattivazione delle cellule T autoreattive all’interno del SNC11.
Considerando l’importanza delle risposte anticorpali nell’autoimmunità del SNC, questo articolo presenta un protocollo basato su ELISA per misurare in modo efficiente i livelli sierici di anticorpi autoreattivi nei topi C57BL/6J EAE immunizzati con peptide MOG35-55. Nella prima parte del protocollo verrà descritto il metodo per raccogliere il siero tramite puntura intracardiaca. Successivamente verranno dettagliate le procedure per impostare il test ELISA e acquisire i dati. Infine, verranno discusse l’analisi e l’interpretazione dei dati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, è stato riportato un protocollo basato su ELISA semplice ed efficiente per quantificare accuratamente la risposta umorale in un modello animale rilevante di patologia della SM. Questo metodo è stato recentemente impiegato per descrivere il nuovo ruolo della proteina atassina-1 nel controllo dei livelli sierici di autoanticorpi nel paradigma EAE MOG35-55/C57BL6J12. A questo proposito, è necessario prendere in considerazione una serie di fattori, al fine di ottenere risultati coerenti e biol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (R03NS131908) e dal Dipartimento della Difesa attraverso il programma di ricerca sulla sclerosi multipla con il premio n. W81XWH-22-1-0517. Le opinioni, le interpretazioni, le conclusioni e le raccomandazioni sono quelle dell’autore e non sono necessariamente approvate dal Dipartimento della Difesa. Questo studio è stato supportato anche dai fondi per le startup della East Carolina University.
Materials
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
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