Quantifizierung autoreaktiver Antikörper in Mäusen nach experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis
Summary
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell für Multiple Sklerose (MS), das mit der menschlichen Krankheit eine robuste humorale Autoimmunreaktion teilt. In dieser Arbeit berichten wir über ein einfaches und flexibles ELISA-Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von EAE-immunisierten Mäusen.
Abstract
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Krankheitsmodell, das die Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose (MS) auf histopathologischer und molekularer Ebene rekapituliert. EAE wird durch Immunisierung von Versuchstieren durch subkutane Injektion von kurzen Myelinpeptiden zusammen mit spezifischen Adjuvantien induziert, um die Immunantwort zu verstärken. Wie das menschliche Gegenstück entwickeln EAE-Mäuse demyelinisierende Läsionen, die Infiltration von Immunzellen in das Zentralnervensystem (ZNS), die Aktivierung von Gliazellen und neuronale Verletzungen. Eine konsistente Evidenz unterstützt auch eine mechanistische Rolle der B-Zell-Dysfunktion in der Ätiologie von MS und EAE. B-Zellen können sowohl als Antigen-präsentierende Zellen als auch als primäre Quelle für entzündungsfördernde Zytokine und Autoantikörper dienen. Bei der EAE werden Antikörper gegen die Myelinpeptide gebildet, die zur Induktion der Krankheit eingesetzt wurden. Es wurde gezeigt, dass solche Autoantikörper entweder den Myelinverlust oder die pathogene Reaktivierung von T-Zellen im ZNS vermitteln. Dieser Artikel beschreibt ein effizientes ELISA-basiertes Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von C57BL/6J-Mäusen, die mit dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein 35-55 (MOG35-55)-Peptid immunisiert wurden. Die vorgeschlagene Methode dient als leistungsfähiges Werkzeug, um die Spezifität und das Ausmaß der aberranten humoralen Reaktion im Zusammenhang mit der autoimmunen Demyelinisierung zu untersuchen.
Introduction
Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems (ZNS), die durch fokale Infiltration von Immunzellen in das Hirnparenchym, den Abbau von Myelinscheiden, die Axone umhüllen, die Gliaaktivierung und neuronalen Verlust gekennzeichnetist 1. Zusätzlich zu der gut etablierten Rolle pathogener T-Zellen haben mehrere Beweise die Beteiligung von B-Zellen an der Vermittlung der Autoimmunantwort gegen das ZNS hervorgehoben. B-Zellen durchlaufen im MS-Gehirn eine klonale Expansion, und Antikörper gegen Myelinkomponenten wurden in demyelinisierten Läsionen nachgewiesen 2,3. Die selektive Aktivierung von peripheren B-Zellen zu Beginn der Erkrankung wurde kürzlich dokumentiert, was auf eine mögliche Rolle dieses Immunzellkompartiments bei der Krankheitsauslösung hindeutet4. Der Erfolg von B-Zell-depletierenden Therapien wie monoklonalen Anti-CD20-Antikörpern bestätigt den mechanistischen Zusammenhang zwischen einer aberranten B-Zell-Funktion und der autoimmunen Demyelinisierung 5,6. Aus molekularer Sicht können B-Zellen über die Präsentation von Autoantigenen, die entzündungsfördernde Zytokinsekretion und die autoreaktive Antikörperproduktion zu Krankheiten beitragen.
Es wurden mehrere Tiermodelle entwickelt, um spezifische Merkmale des komplexen MS-Phänotyps zu rekapitulieren. Unter ihnen ist die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) das am weitesten verbreitete In-vivo-Paradigma und beruht auf der Immunisierung von Versuchstieren mit kurzen Peptiden, die von Myelinproteinen wie dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) und dem Myelin-Basisprotein (MBP) abgeleitet sind7. EAE-immunisierte Tiere entwickeln eine demyelinisierende Pathologie, die der MS in vielen Aspekten ähnelt, einschließlich einer robusten humoralen Reaktion gegen das enzephalitogene Peptid8. Aus diesem Grund haben EAE-Studien maßgeblich dazu beigetragen, die Funktion von B-Zellen und Autoantikörpern im Rahmen von Krankheiten zu entschlüsseln. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass MOG-spezifische Antikörper, die von MS-Patienten isoliert wurden, den klinischen Verlauf in EAE-Modellen verschlimmern können9. Insbesondere wurde gezeigt, dass der Prolinrest an Position 42 in humanem MOG entscheidend für die Bestimmung der Autoantikörper-Pathogenitätist 10. In jüngerer Zeit wurde festgestellt, dass MOG-spezifische Autoantikörper die Krankheit nicht nur fördern, indem sie den Myelinverlust vermitteln, sondern auch die Reaktivierung autoreaktiver T-Zellen im ZNS verstärken11.
Unter Berücksichtigung der Bedeutung von Antikörperreaktionen bei der ZNS-Autoimmunität wird in diesem Artikel ein ELISA-basiertes Protokoll zur effizienten Messung der Serumspiegel von autoreaktiven Antikörpern in C57BL/6J-Mäusen vorgestellt, die mit dem MOG35-55-Peptid immunisiert wurden. Im ersten Teil des Protokolls wird die Methode zur Serumgewinnung mittels intrakardialer Punktion beschrieben. Anschließend werden die Verfahren zur Einrichtung des ELISA-Assays und zur Erfassung der Daten detailliert beschrieben. Zuletzt wird die Datenanalyse und -interpretation diskutiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wurde über ein einfaches und effizientes ELISA-basiertes Protokoll berichtet, um die humorale Reaktion in einem relevanten Tiermodell der MS-Pathologie genau zu quantifizieren. Diese Methode wurde kürzlich eingesetzt, um die neuartige Rolle des Ataxin-1-Proteins bei der Kontrolle der Serumspiegel von Autoantikörpern im MOG35-55/C57BL6J EAE-Paradigma12 zu beschreiben. In diesem Zusammenhang sollten eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden, um mit dieser Methode konsistente und biologi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (R03NS131908) und dem Verteidigungsministerium im Rahmen des Multiple Sclerosis Research Program unter der Fördernummer W81XWH-22-1-0517 unterstützt. Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die des Autors und werden nicht unbedingt vom Verteidigungsministerium unterstützt. Diese Studie wurde auch von Startup-Fonds der East Carolina University unterstützt.
Materials
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
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