Количественная оценка аутореактивных антител у мышей при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите
Summary
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) — это животная модель рассеянного склероза (РС), которая разделяет с болезнью человека устойчивый гуморальный аутоиммунный ответ. Здесь мы сообщаем о простом и гибком протоколе ИФА для количественного определения аутоантител в сыворотке мышей, иммунизированных EAE.
Abstract
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) — это модель заболевания, которая повторяет аутоиммунное заболевание рассеянный склероз (РС) на гистопатологическом и молекулярном уровнях. ЭАЭ индуцируется иммунизацией экспериментальных животных путем подкожной инъекции коротких пептидов миелина вместе со специфическими адъювантами для усиления иммунного ответа. Как и у человека, у мышей EAE развиваются демиелинизирующие поражения, инфильтрация иммунных клеток в центральную нервную систему (ЦНС), активация глии и повреждение нейронов. Последовательная совокупность доказательств также поддерживает механистическую роль дисфункции В-клеток в этиологии как РС, так и ЭАЭ. В-клетки могут служить антигенпрезентирующими клетками, а также основным источником провоспалительных цитокинов и аутоантител. При EAE вырабатываются антитела против пептидов миелина, которые были использованы для индуцирования заболевания. Было показано, что такие аутоантитела опосредуют либо потерю миелина, либо реактивацию патогенных Т-клеток в ЦНС. В данной статье описан эффективный протокол на основе ИФА для количественного определения аутоантител в сыворотке крови мышей C57BL/6J, иммунизированных пептидом миелина олигодендроцитарного гликопротеина 35-55 (MOG35-55). Предложенный метод служит мощным инструментом для исследования специфичности и величины аберрантного гуморального ответа в контексте аутоиммунной демиелинизации.
Introduction
Рассеянный склероз (РС) — это хроническое аутоиммунное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), характеризующееся очаговой инфильтрацией иммунных клеток в паренхиму головного мозга, разрушением миелиновых оболочек, обволакивающих аксоны, активацией глии и потерей нейронов1. В дополнение к хорошо установленной роли патогенных Т-клеток, многочисленные линии доказательств подчеркнули участие В-клеток в опосредовании аутоиммунного ответа против ЦНС. В-клетки подвергаются клональной экспансии в мозге РС, и антитела против компонентов миелина были обнаружены в демиелинизированных поражениях 2,3. Недавно была задокументирована селективная активация периферических В-клеток в начале заболевания, что предполагает предполагаемую роль этого компартмента иммунных клеток в инициации заболевания4. Успех терапии, истощающей В-клетки, такой как моноклональные антитела против CD20, еще больше подтверждает механистическую связь между аберрантным функционированием В-клеток и аутоиммунной демиелинизацией 5,6. С молекулярной точки зрения, В-клетки могут способствовать заболеванию через презентацию аутоантигена, секрецию провоспалительных цитокинов и выработку аутореактивных антител.
Было разработано несколько животных моделей, чтобы обобщить специфические особенности сложного фенотипа рассеянного склероза. Среди них экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является наиболее широко используемой парадигмой in vivo и опирается на иммунизацию экспериментальных животных короткими пептидами, полученными из белков миелина, таких как гликопротеин миелина олигодендроцитов (MOG) и основной белок миелина (MBP)7. У животных, иммунизированных EAE, развивается демиелинизирующая патология, которая во многих аспектах напоминает рассеянный склероз, включая устойчивый гуморальный ответ против энцефалитогенного пептида8. По этой причине исследования ЭАЭ сыграли важную роль в анализе функции В-клеток и аутоантител в контексте заболевания. Например, было показано, что MOG-специфические антитела, выделенные у пациентов с РС, могут усугубить клиническое течение в модели ЭАЭ9. Примечательно, что остаток пролина в положении 42 в MOG человека имеет решающее значение для определения патогенности аутоантител10. Совсем недавно было обнаружено, что MOG-специфические аутоантитела способствуют заболеванию не только за счет опосредования потери миелина, но и за счет повышения реактивации аутореактивных Т-клеток в ЦНС11.
Учитывая важность ответов антител при аутоиммунных заболеваниях ЦНС, в данной статье представлен протокол на основе ИФА для эффективного измерения сывороточных уровней аутореактивных антител у мышей ЭАЭ C57BL/6J, иммунизированных пептидом MOG35-55. В первой части протокола будет описан метод сбора сыворотки с помощью внутрисердечной пункции. Затем будут подробно описаны процедуры настройки ИФА-анализа и получения данных. Наконец, будет обсуждаться анализ и интерпретация данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь сообщалось о простом и эффективном протоколе на основе ИФА для точной количественной оценки гуморального ответа в соответствующей животной модели патологии рассеянного склероза. Этот метод недавно был использован для описания новой роли белка атаксина-1 в контроле сывороточны?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения (R03NS131908) и Министерством обороны в рамках Программы исследований рассеянного склероза в рамках награды No W81XWH-22-1-0517. Мнения, интерпретации, выводы и рекомендации принадлежат автору и не обязательно одобрены Министерством обороны. Это исследование также было поддержано стартап-фондами Университета Восточной Каролины.
Materials
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
- Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
- Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
- Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
- Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
- Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
- Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
- Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
- Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
- Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).
