القياس الكمي للأجسام المضادة ذاتية التفاعل في الفئران عند التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي
Summary
التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج حيواني للتصلب المتعدد (MS) ، والذي يشترك مع المرض البشري في استجابة مناعة ذاتية خلطية قوية. هنا ، نبلغ عن بروتوكول ELISA بسيط ومرن لتحديد الأجسام المضادة الذاتية في مصل الفئران المحصنة EAE.
Abstract
التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو نموذج مرض يلخص اضطراب المناعة الذاتية التصلب المتعدد (MS) على المستويات النسيجية والجزيئية. يتم تحفيز EAE عن طريق تحصين التجارب عن طريق الحقن تحت الجلد من ببتيدات المايلين القصيرة مع مواد مساعدة محددة لتعزيز الاستجابة المناعية. مثل النظير البشري ، تصاب الفئران EAE بآفات مزيل للميالين ، وتسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، وتنشيط الخلايا الدبقية وإصابة الخلايا العصبية. تدعم مجموعة متسقة من الأدلة أيضا دورا ميكانيكيا لخلل الخلايا البائية في مسببات كل من MS و EAE. يمكن أن تعمل الخلايا البائية كخلايا مقدمة لمولد الضد، وكذلك مصدرا أساسيا للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات والأجسام المضادة الذاتية. في EAE ، يتم إنشاء الأجسام المضادة ضد ببتيدات المايلين التي تم استخدامها للحث على المرض. وقد ثبت أن هذه الأجسام المضادة الذاتية تتوسط إما فقدان المايلين أو إعادة تنشيط الخلايا التائية المسببة للأمراض في الجهاز العصبي المركزي. توضح هذه المقالة بروتوكولا فعالا قائما على ELISA لتحديد الأجسام المضادة الذاتية في مصل الفئران C57BL / 6J المحصنة بببتيد البروتين السكري قليل التغصن المايلين 35-55 (MOG35-55). تعمل الطريقة المقترحة كأداة قوية للتحقيق في خصوصية وحجم الاستجابة الخلطية الشاذة في سياق إزالة الميالين المناعي الذاتي.
Introduction
التصلب المتعدد (MS) هو مرض مناعي ذاتي مزمن يصيب الجهاز العصبي المركزي (CNS) يتميز بالتسلل البؤري للخلايا المناعية إلى حمة الدماغ ، وانهيار أغماد المايلين التي تغلف محاور عصبية ، وتنشيط الخلايا الدبقية ، وفقدان الخلايا العصبية1. بالإضافة إلى الدور الراسخ للخلايا التائية المسببة للأمراض ، سلطت خطوط متعددة من الأدلة الضوء على تورط الخلايا البائية في التوسط في استجابة المناعة الذاتية ضد الجهاز العصبي المركزي. تخضع الخلايا البائية للتوسع النسيلي في دماغ مرض التصلب العصبي المتعدد وتم اكتشاف الأجسام المضادة ضد مكونات المايلين داخل الآفات المنزوعة الميالين 2,3. تم مؤخرا توثيق التنشيط الانتقائي للخلايا البائية المحيطية في بداية المرض ، مما يشير إلى دور مفترض لحجرة الخلايا المناعية هذه في بدء المرض أيضا4. يؤكد نجاح العلاجات المستنفدة للخلايا البائية مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل CD20 العلاقة الميكانيكية بين عمل الخلايا البائية الشاذة وإزالة الميالين المناعي الذاتي 5,6. من وجهة نظر جزيئية، يمكن أن تسهم الخلايا البائية في الإصابة بالمرض عن طريق عرض مولد الضد الذاتي، وإفراز السيتوكين المؤيد للالتهابات، وإنتاج الأجسام المضادة ذاتية التفاعل.
تم تطوير نماذج حيوانية متعددة لتلخيص السمات المحددة للنمط الظاهري المعقد لمرض التصلب العصبي المتعدد. من بينها ، التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) هو الأكثر استخداما في نموذج الجسم الحي ويعتمد على تحصين التجارب بالببتيدات القصيرة المشتقة من بروتينات المايلين مثل البروتين السكري قليل التغصن المايلين (MOG) وبروتين المايلين الأساسي (MBP)7. تطور المحصنة EAE أمراضا مزيل للميالين تشبه مرض التصلب العصبي المتعدد في العديد من الجوانب ، بما في ذلك الاستجابة الخلطية القوية ضد الببتيدالدماغي 8. لهذا السبب ، كانت دراسات EAE مفيدة في تشريح وظيفة الخلايا البائية والأجسام المضادة الذاتية في سياق المرض. على سبيل المثال ، ثبت أن الأجسام المضادة الخاصة ب MOG المعزولة من مرضى التصلب العصبي المتعدد يمكن أن تؤدي إلى تفاقم المسار السريري في نماذج EAE9. والجدير بالذكر أن بقايا البرولين في الموضع 42 في MOG البشري تبين أنها حاسمة لتحديد إمراضية الأجسام المضادةالذاتية 10. في الآونة الأخيرة ، تم العثور على الأجسام المضادة الذاتية الخاصة ب MOG لتعزيز المرض ليس فقط عن طريق التوسط في فقدان المايلين ولكن أيضا عن طريق تعزيز إعادة تنشيط الخلايا التائية ذاتية التفاعل داخل الجهاز العصبيالمركزي 11.
بالنظر إلى أهمية استجابات الأجسام المضادة في المناعة الذاتية للجهاز العصبي المركزي ، تقدم هذه المقالة بروتوكولا قائما على ELISA لقياس مستويات مصل الأجسام المضادة ذاتية التفاعل بكفاءة في الفئران C57BL / 6J EAE المحصنة بببتيد MOG35-55. في الجزء الأول من البروتوكول ، سيتم وصف طريقة جمع المصل عن طريق ثقب داخل القلب. بعد ذلك ، سيتم تفصيل إجراءات إعداد اختبار ELISA والحصول على البيانات. أخيرا ، سيتم مناقشة تحليل البيانات وتفسيرها.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، تم الإبلاغ عن بروتوكول بسيط وفعال قائم على ELISA لتحديد الاستجابة الخلطية بدقة في نموذج حيواني ذي صلة لأمراض التصلب العصبي المتعدد. تم استخدام هذه الطريقة مؤخرا لوصف الدور الجديد لبروتين ataxin-1 في التحكم في مستويات مصل الأجسام المضادة الذاتية في نموذج MOG35-55 / C57BL6J EAE12. في هذا ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R03NS131908) ووزارة الدفاع من خلال برنامج أبحاث التصلب المتعدد بموجب الجائزة رقم W81XWH-22-1-0517. الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي آراء المؤلف ولا تقرها بالضرورة وزارة الدفاع. تم دعم هذه الدراسة أيضا من قبل صناديق بدء التشغيل بجامعة شرق كارولينا.
Materials
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
- Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
- Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
- Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
- Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
- Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
- Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
- Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
- Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
- Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).
