Kwantificering van autoreactieve antilichamen bij muizen bij experimentele auto-immuunencefalomyelitis
Summary
Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een diermodel van multiple sclerose (MS), dat met de menselijke ziekte een robuuste humorale auto-immuunrespons deelt. Hier rapporteren we een eenvoudig en flexibel ELISA-protocol om auto-antilichamen in het serum van EAE-geïmmuniseerde muizen te kwantificeren.
Abstract
Experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE) is een ziektemodel dat de auto-immuunziekte multiple sclerose (MS) op histopathologisch en moleculair niveau recapituleert. EAE wordt geïnduceerd door het immuniseren van proefdieren via subcutane injectie van korte myelinepeptiden samen met specifieke adjuvantia om de immuunrespons te versterken. Net als de menselijke tegenhanger ontwikkelen EAE-muizen demyeliniserende laesies, infiltratie van immuuncellen in het centrale zenuwstelsel (CZS), glia-activering en neuronaal letsel. Een consistente hoeveelheid bewijs ondersteunt ook een mechanistische rol voor B-celdisfunctie in de etiologie van zowel MS als EAE. B-cellen kunnen dienen als antigeenpresenterende cellen en als een primaire bron van pro-inflammatoire cytokines en auto-antilichamen. Bij EAE worden antilichamen gegenereerd tegen de myelinepeptiden die werden gebruikt om de ziekte te induceren. Van dergelijke auto-antilichamen is aangetoond dat ze ofwel myelineverlies ofwel pathogene reactivering van T-cellen in het CZS mediëren. Dit artikel beschrijft een efficiënt op ELISA gebaseerd protocol om auto-antilichamen te kwantificeren in het serum van C57BL/6J-muizen die zijn geïmmuniseerd met het myeline-oligodendrocytglycoproteïne 35-55 (MOG35-55) peptide. De voorgestelde methode dient als een krachtig hulpmiddel om de specificiteit en omvang van de afwijkende humorale respons in de context van auto-immuundemyelinisatie te onderzoeken.
Introduction
Multiple sclerose (MS) is een chronische auto-immuunziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) die wordt gekenmerkt door focale infiltratie van immuuncellen in het hersenparenchym, afbraak van myelineschulzen die axonen omhullen, glia-activering en neuronaal verlies1. Naast de gevestigde rol van pathogene T-cellen, hebben meerdere bewijslijnen de betrokkenheid van B-cellen bij het mediëren van de auto-immuunrespons tegen het CZS benadrukt. B-cellen ondergaan klonale expansie in de MS-hersenen en antilichamen tegen myelinecomponenten zijn gedetecteerd in demyelinistische laesies 2,3. De selectieve activering van perifere B-cellen bij het begin van de ziekte is onlangs gedocumenteerd, wat suggereert dat dit immuuncelcompartiment ook een vermeende rol speelt bij het ontstaan van de ziekte4. Het succes van B-cel-afbrekende therapieën zoals anti-CD20 monoklonale antilichamen bevestigt verder het mechanistische verband tussen afwijkende B-celwerking en auto-immuundemyelinisatie 5,6. Vanuit moleculair oogpunt kunnen B-cellen bijdragen aan ziekte via auto-antigeenpresentatie, pro-inflammatoire cytokinesecretie en autoreactieve productie van antilichamen.
Er zijn meerdere diermodellen ontwikkeld om specifieke kenmerken van het complexe MS-fenotype te recapituleren. Onder hen is experimentele auto-immuunencefalomyelitis (EAE) het meest gebruikte in vivo paradigma en berust op de immunisatie van proefdieren met korte peptiden afgeleid van myeline-eiwitten zoals myeline-oligodendrocytglycoproteïne (MOG) en myeline-basisch eiwit (MBP)7. EAE-geïmmuniseerde dieren ontwikkelen een demyeliniserende pathologie die in veel opzichten op MS lijkt, waaronder een robuuste humorale respons tegen het encefalitogene peptide8. Om deze reden hebben EAE-studies een belangrijke rol gespeeld bij het ontleden van de functie van B-cellen en auto-antilichamen in de context van ziekte. Zo werd bijvoorbeeld aangetoond dat MOG-specifieke antilichamen geïsoleerd uit MS-patiënten het klinische beloop kunnen verergeren in EAE-modellen9. Met name het prolineresidu op positie 42 in menselijke MOG bleek cruciaal te zijn voor het bepalen van de pathogeniteit van auto-antilichamen10. Meer recentelijk is gebleken dat MOG-specifieke auto-antilichamen de ziekte bevorderen, niet alleen door myelineverlies te mediëren, maar ook door de reactivering van autoreactieve T-cellen in het CZSte stimuleren 11.
Gezien het belang van antilichaamresponsen bij auto-immuniteit van het CZS, presenteert dit artikel een op ELISA gebaseerd protocol om de serumspiegels van autoreactieve antilichamen efficiënt te meten bij C57BL/6J-muizen EAE geïmmuniseerd met MOG35-55-peptide. In het eerste deel van het protocol wordt de methode beschreven om serum af te nemen via een intracardiale punctie. Vervolgens zullen de procedures voor het opzetten van de ELISA-test en het verkrijgen van de gegevens in detail worden beschreven. Tot slot komt de data-analyse en -interpretatie aan bod.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier werd een eenvoudig en efficiënt op ELISA gebaseerd protocol gerapporteerd om de humorale respons nauwkeurig te kwantificeren in een relevant diermodel van MS-pathologie. Deze methode is onlangs gebruikt om de nieuwe rol van het ataxine-1-eiwit te beschrijven bij het beheersen van de serumspiegels van auto-antilichamen in het MOG35-55/C57BL6J EAE-paradigma12. In dit opzicht moet met een aantal factoren rekening worden gehouden om consistente en biologisch zinvolle resultaten met deze methode …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health (R03NS131908) en het ministerie van Defensie via het Multiple Sclerosis Research Program onder Award No. W81XWH-22-1-0517. Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteur en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van Defensie. Deze studie werd ook ondersteund door startup-fondsen van de East Carolina University.
Materials
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
- Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
- Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
- Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
- Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
- Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
- Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
- Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
- Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
- Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).
