Cuantificación de anticuerpos autorreactivos en ratones tras encefalomielitis autoinmune experimental
Summary
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo animal de esclerosis múltiple (EM), que comparte con la enfermedad humana una respuesta autoinmune humoral robusta. En este trabajo presentamos un protocolo ELISA sencillo y flexible para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones inmunizados con EAE.
Abstract
La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es un modelo de enfermedad que recapitula el trastorno autoinmune esclerosis múltiple (EM) a nivel histopatológico y molecular. La EAE se induce mediante la inmunización de animales de experimentación mediante inyección subcutánea de péptidos de mielina corta junto con adyuvantes específicos para impulsar la respuesta inmunitaria. Al igual que los humanos, los ratones EAE desarrollan lesiones desmielinizantes, infiltración de células inmunitarias en el sistema nervioso central (SNC), activación de la glía y lesión neuronal. Un cuerpo consistente de evidencia también apoya un papel mecanicista para la disfunción de las células B en la etiología tanto de la EM como de la EAE. Las células B pueden servir como células presentadoras de antígenos, así como una fuente principal de citocinas proinflamatorias y autoanticuerpos. En la EAE, se generan anticuerpos contra los péptidos de mielina que se emplearon para inducir la enfermedad. Se ha demostrado que estos autoanticuerpos median la pérdida de mielina o la reactivación patogénica de las células T en el SNC. Este artículo describe un protocolo eficiente basado en ELISA para cuantificar autoanticuerpos en el suero de ratones C57BL/6J inmunizados con el péptido glicoproteína de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG35-55). El método propuesto sirve como una poderosa herramienta para investigar la especificidad y magnitud de la respuesta humoral aberrante en el contexto de la desmielinización autoinmune.
Introduction
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad autoinmune crónica del sistema nervioso central (SNC) caracterizada por la infiltración focal de células inmunitarias en el parénquima cerebral, la ruptura de las vainas de mielina que envuelven los axones, la activación de la glía y la pérdida neuronal1. Además del papel bien establecido de las células T patógenas, múltiples líneas de evidencia han destacado la participación de las células B en la mediación de la respuesta autoinmune contra el SNC. Las células B experimentan una expansión clonal en el cerebro de la EM y se han detectado anticuerpos contra los componentes de la mielina dentro de las lesiones desmielinizadas 2,3. Recientemente se ha documentado la activación selectiva de las células B periféricas al inicio de la enfermedad, lo que sugiere un papel putativo de este compartimento de células inmunitarias también en el inicio de la enfermedad4. El éxito de las terapias de agotamiento de linfocitos B, como los anticuerpos monoclonales anti-CD20, corrobora aún más la conexión mecanicista entre el funcionamiento aberrante de los linfocitos B y la desmielinización autoinmune 5,6. Desde un punto de vista molecular, las células B pueden contribuir a la enfermedad a través de la presentación de autoantígenos, la secreción de citocinas proinflamatorias y la producción de anticuerpos autorreactivos.
Se han desarrollado múltiples modelos animales para recapitular las características específicas del complejo fenotipo de la EM. Entre ellos, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el paradigma in vivo más utilizado y se basa en la inmunización de animales de experimentación con péptidos cortos derivados de proteínas de mielina como la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) y la proteína básica de mielina (MBP)7. Los animales inmunizados con EAE desarrollan una patología desmielinizante que se asemeja a la EM en muchos aspectos, incluyendo una respuesta humoral robusta frente al péptido encefalogénico8. Por este motivo, los estudios de EAE han sido fundamentales para diseccionar la función de las células B y los autoanticuerpos en el contexto de la enfermedad. Por ejemplo, se demostró que los anticuerpos específicos de MOG aislados de pacientes con EM pueden agravar el curso clínico en modelos EAE9. En particular, se demostró que el residuo de prolina en la posición 42 en el MOG humano es crítico para determinar la patogenicidad de los autoanticuerpos10. Más recientemente, se ha descubierto que los autoanticuerpos específicos de MOG promueven la enfermedad no solo al mediar la pérdida de mielina, sino también al estimular la reactivación de las células T autorreactivas dentro del SNC11.
Teniendo en cuenta la importancia de las respuestas de anticuerpos en la autoinmunidad del SNC, este artículo presenta un protocolo basado en ELISA para medir de manera eficiente los niveles séricos de anticuerpos autorreactivos en ratones C57BL/6J EAE inmunizados con el péptido MOG35-55. En la primera parte del protocolo se describirá el método de recogida de suero mediante punción intracardíaca. Posteriormente, se detallarán los procedimientos para configurar el ensayo ELISA y adquirir los datos. Por último, se discutirá el análisis e interpretación de los datos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se informó de un protocolo simple y eficiente basado en ELISA para cuantificar con precisión la respuesta humoral en un modelo animal relevante de patología de EM. Este método se ha empleado recientemente para describir el nuevo papel de la proteína ataxina-1 en el control de los niveles séricos de autoanticuerpos en el paradigma MOG35-55/C57BL6J EAE12. En este sentido, se deben tener en cuenta una serie de factores para obtener resultados consistentes y biológicamente significativos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R03NS131908) y el Departamento de Defensa a través del Programa de Investigación de Esclerosis Múltiple bajo el Premio No. W81XWH-22-1-0517. Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa. Este estudio también contó con el apoyo de fondos iniciales de la Universidad de Carolina del Este.
Materials
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. Multiple sclerosis. N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
- Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
- Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
- Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
- Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
- Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
- Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
- Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
- Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
- Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).
