İnsan Nötrofillerinde Nötrofil Hücre Dışı Tuzakların Oluşumunu Ölçmek için Gerçek Zamanlı Yüksek Verim Tekniği
Summary
Canlı hücre analiz sistemini kullanarak nötrofil hücre dışı tuzaklarını (NET’ler) ölçmek için membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımıyla birleştirilmiş otomatik bir yüksek verimli yöntem sunuyoruz.
Abstract
Nötrofiller, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin çok önemli bir bölümünü oluşturan miyeloid soy hücreleridir. Son on yılda, nötrofillerin, antimikrobiyal savunmada çok önemli yapılar olan nötrofil hücre dışı tuzakların (NET’ler) oluşumu da dahil olmak üzere çoklu mekanizmalar yoluyla immün düzensizliğin başlatılmasına ve sürdürülmesine katkıda bulunarak kanser, otoimmün hastalıklar ve çeşitli akut ve kronik inflamatuar durumların patogenezinde oynadığı ek kilit roller ortaya çıkmıştır. NET oluşumunu tarafsız, tekrarlanabilir ve verimli bir şekilde ölçme tekniklerindeki sınırlamalar, nötrofillerin sağlık ve hastalıklardaki rolünü daha iyi anlama yeteneğimizi kısıtlamıştır. Hücre içi ve hücre dışı DNA’yı görüntülemek için iki farklı DNA boyası kullanan bir membran geçirgenliğine bağlı çift boya yaklaşımı ile birleştirilmiş bir canlı hücre görüntüleme platformu kullanarak NET oluşumuna uğrayan nötrofillerin miktarını belirlemek için otomatik, gerçek zamanlı, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz. Bu metodoloji, nötrofil fizyolojisinin değerlendirilmesine ve NET oluşumunu hedefleyebilen moleküllerin test edilmesine yardımcı olabilir.
Introduction
Nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET’ler), çeşitli enflamatuar uyaranlara yanıt olarak nötrofillerden ekstrüde edilen ağ benzeri kromatin yapılardır. NET’ler, enfeksiyöz patojenleri yakalayan ve öldüren ve inflamatuar yanıtları tetikleyen DNA, histonlar ve çeşitli anti-mikrobiyal proteinler/peptitlerden oluşur1.
NET’ler patojenlere karşı konak savunması için faydalı olmakla birlikte, çeşitli otoimmün hastalıkların2, tromboz3, metabolik hastalıkların4 ve kanserlerin metastatik büyümesinin5 potansiyel bir itici gücü olarak dikkat çekmiştir. Bu nedenle, NET oluşumunun inhibisyonu bu hastalıklar için potansiyel bir terapötik seçenektir. Bununla birlikte, gelişim6’daki bazı umut verici NET hedefleme moleküllerine rağmen, bu mekanizmayı spesifik olarak etkileyen onaylanmış bir tedavi hala yoktur. Bu, en azından kısmen, NET oluşumu için nesnel, tarafsız, tekrarlanabilir ve yüksek verimli niceleme yöntemlerinin eksikliğine atfedilebilir.
Çift renkli canlı hücre görüntüleme platformu 7,8 kullanan yeni bir yöntem oluşturduk ve raporladık. Membran geçirgen nükleer boya ve membran geçirimsiz DNA boyası ile boyanmış nötrofillerin hızlandırılmış görüntüleri yazılım tarafından analiz edilir ve NET oluşturma öncesi ve sonrası nötrofillerin sayıları birden fazla zaman noktasında sayılır. PKCa aracılı Lamin B ve CDK4/6 aracılı Lamin A/C demontajı9’un düzenlenmesi ile NET oluşumu sırasında plazma zarının bütünlüğü kaybolduğundan, NET oluşturan nötrofiller membran geçirimsiz DNA boyası ile boyanırken, sağlıklı nötrofiller boyanmaz. Bu yöntem, NET oluşumunu ölçmek için daha önce bildirilen tekniklerin sorunlarının üstesinden gelir ve otomatik bir şekilde tarafsız, yüksek verimli, tekrarlanabilir ve doğru NET nicelemesi sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
NET’leri ex vivo ölçmek için mevcut yöntemlerin, nötrofilleri, NET’leri ve potansiyel terapötik hedefleri tarafsız ve yüksek verimli bir şekilde inceleme yeteneğimizi sınırlayan çeşitli dezavantajları vardır10,14. Örneğin, NET’lerin miktar tayini için altın standart olarak kabul edilen immünofloresan boyamadan sonra NET oluşturan hücrelerin doğrudan sayımı düşük verimlidir ve operatörün öznel görüşüne bağlıdır. Memb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ulusal Artrit ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü Bilim ve Teknoloji Ofisi’ndeki Işık Görüntüleme Bölümüne teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Artrit ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü’nün (ZIA AR041199) İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
