Technique à haut débit en temps réel pour quantifier la formation de pièges extracellulaires à neutrophiles dans les neutrophiles humains

Summary

Nous présentons une méthode automatisée à haut débit pour quantifier les pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles en utilisant le système d’analyse de cellules vivantes, couplée à une approche à double colorant dépendant de la perméabilité membranaire.

Abstract

Les neutrophiles sont des cellules de la lignée myéloïde qui constituent une partie cruciale du système immunitaire inné. La dernière décennie a révélé d’autres rôles clés que jouent les neutrophiles dans la pathogenèse du cancer, des maladies auto-immunes et de diverses affections inflammatoires aiguës et chroniques en contribuant à l’initiation et à la perpétuation de la dérégulation immunitaire par de multiples mécanismes, y compris la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), qui sont des structures cruciales dans la défense antimicrobienne. Les limites des techniques de quantification de la formation de TNE de manière impartiale, reproductible et efficace ont limité notre capacité à mieux comprendre le rôle des neutrophiles dans la santé et les maladies. Nous décrivons une méthode automatisée, en temps réel et à haut débit pour quantifier les neutrophiles en cours de formation de TNE à l’aide d’une plateforme d’imagerie de cellules vivantes couplée à une approche à double colorant dépendant de la perméabilité membranaire utilisant deux colorants d’ADN différents pour imager l’ADN intracellulaire et extracellulaire. Cette méthodologie permet d’évaluer la physiologie des neutrophiles et de tester des molécules capables de cibler la formation de TNE.

Introduction

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont des structures chromatiniennes en forme de toile extrudées à partir de neutrophiles en réponse à divers stimuli inflammatoires. Les TNE sont composées d’ADN, d’histones et de diverses protéines/peptides antimicrobiens, qui piègent et tuent les agents pathogènes infectieux et provoquent des réponses inflammatoires¹.

Bien que les TNE soient bénéfiques pour la défense de l’hôte contre les agents pathogènes, elles ont attiré l’attention en tant que moteur potentiel de diverses maladies auto-immunes², thrombose³, maladies métaboliques⁴ et croissance métastatique des cancers⁵. En tant que tel, l’inhibition de la formation de TNE est une option thérapeutique potentielle pour ces maladies. Cependant, malgré certaines molécules prometteuses ciblant les TNE en développement⁶, il n’existe toujours pas de traitement approuvé qui affecte spécifiquement ce mécanisme. Cela est, au moins en partie, attribuable à l’absence de méthodes de quantification objectives, non biaisées, reproductibles et à haut débit pour la formation de TNE.

Nous avons établi et rapporté une nouvelle méthode utilisant une plateforme d’imagerie bicolore de cellules vivantes ^7,8. Des images en accéléré de neutrophiles colorés avec un colorant nucléaire perméable à la membrane et un colorant d’ADN imperméable à la membrane sont analysées par le logiciel, et le nombre de neutrophiles pré et post-formation de TNE est compté à plusieurs moments. Étant donné que l’intégrité de la membrane plasmique est perdue lors de la formation des TNE par la régulation de la lamine B médiée par PKCα et du désassemblage de la lamine A/C médiée par CDK4/6⁹, les neutrophiles formant des TNE sont colorés par un colorant d’ADN imperméable à la membrane, contrairement aux neutrophiles sains. Cette méthode surmonte les problèmes des techniques précédemment rapportées pour quantifier la formation de NET et fournit une quantification non biaisée, à haut débit, reproductible et précise de manière automatisée.

Protocol

Les neutrophiles provenant de sujets humains sains ont été obtenus après consentement éclairé dans le cadre du protocole approuvé par le National Institutes of Health (NIH) Institutional Review Board (IRB). Le protocole suit les directives du comité d’éthique de la recherche humaine des NIH. 1. Coloration des neutrophiles et préparation de la plaque de dosage Prélever du sang périphérique avec le consentement éclairé écrit approprié conformément au…

Representative Results

Cette méthode fournit des images à contraste de phase, fluorescentes rouges (colorant perméable à la membrane) et fluorescentes vertes (colorant imperméable à la membrane) prises à chaque point temporel. Parallèlement au processus de formation des NET, des changements morphologiques sont observés dans les images à contraste de phase et fluorescentes rouges, et une fois la membrane percée, une fluorescence verte peut être observée (Figure 1). Dans ce test, les neutrophiles forman…

Discussion

Les méthodes actuelles de quantification des TNE ex vivo présentent plusieurs inconvénients qui limitent notre capacité à étudier les neutrophiles, les TNE et les cibles thérapeutiques potentielles de manière impartiale et à haut débit^10,14. Par exemple, le comptage direct des cellules formant des TNE après coloration immunofluorescente, considéré comme l’étalon-or pour la quantification des TNE, est à faible débit et dépend de la visi…

Materials

AKT inhibitor	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye	Thermo Fisher Scientific	S7020
Nuclear red dye	Enzo	ENZ-52406	Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Phenol red containig RPMI can be used.