Técnica de alto rendimiento en tiempo real para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos humanos

Summary

Presentamos un método automatizado de alto rendimiento para cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) utilizando el sistema de análisis de células vivas, junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana.

Abstract

Los neutrófilos son células de linaje mieloide que forman una parte crucial del sistema inmunitario innato. La última década ha revelado funciones clave adicionales que desempeñan los neutrófilos en la patogénesis del cáncer, las enfermedades autoinmunes y diversas afecciones inflamatorias agudas y crónicas al contribuir al inicio y la perpetuación de la desregulación inmunitaria a través de múltiples mecanismos, incluida la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que son estructuras cruciales en la defensa antimicrobiana. Las limitaciones en las técnicas para cuantificar la formación de NET de una manera imparcial, reproducible y eficiente han restringido nuestra capacidad para comprender mejor el papel de los neutrófilos en la salud y las enfermedades. Describimos un método automatizado, en tiempo real y de alto rendimiento para cuantificar neutrófilos que experimentan formación de NET utilizando una plataforma de imágenes de células vivas junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana que utiliza dos colorantes de ADN diferentes para obtener imágenes de ADN intracelular y extracelular. Esta metodología es capaz de ayudar a evaluar la fisiología de los neutrófilos y probar moléculas que pueden dirigirse a la formación de NET.

Introduction

Las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) son estructuras de cromatina en forma de red extruidas de neutrófilos en respuesta a diversos estímulos inflamatorios. Los TNE están compuestos de ADN, histonas y varias proteínas/péptidos antimicrobianos, que atrapan y matan patógenos infecciosos e invocan respuestas inflamatorias¹.

Si bien los TNE son beneficiosos para la defensa del huésped contra los patógenos, han llamado la atención como un posible impulsor de diversas enfermedades autoinmunes², trombosis³, enfermedades metabólicas⁴ y crecimiento metastásico de cánceres⁵. Por lo tanto, la inhibición de la formación de NET es una opción terapéutica potencial para estas enfermedades. Sin embargo, a pesar de que se están desarrollando algunas moléculas prometedoras dirigidas a los NETs⁶, todavía no existe una terapia aprobada que afecte específicamente a este mecanismo. Esto se debe, al menos en parte, a la falta de métodos de cuantificación objetivos, imparciales, reproducibles y de alto rendimiento para la formación de NET.

Establecimos y reportamos un nuevo método que utiliza una plataforma de imágenes de células vivas de dos colores ^7,8. El software analiza las imágenes de lapso de tiempo de neutrófilos teñidos con colorante nuclear permeable a la membrana y colorante de ADN impermeable a la membrana, y el número de neutrófilos antes y después de la formación de NET se cuenta en múltiples puntos de tiempo. Dado que la integridad de la membrana plasmática se pierde durante la formación de NET por la regulación del^{desensamblaje} de Lamin B mediado por PKCα y Lamin A/C mediado por CDK4/6 9, los neutrófilos formadores de NET se tiñen con un colorante de ADN impermeable a la membrana, mientras que los neutrófilos sanos no lo hacen. Este método supera los problemas de las técnicas previamente informadas para cuantificar la formación de NET y proporciona una cuantificación de NET imparcial, de alto rendimiento, reproducible y precisa de manera automatizada.

Protocol

Los neutrófilos de sujetos humanos sanos se obtuvieron después de que se proporcionara el consentimiento informado según el protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El protocolo sigue las directrices del comité de ética de la investigación en seres humanos de los NIH. 1. Tinción de los neutrófilos y preparación de la placa de ensayo Tomar sangre periférica con el consentimiento informado p…

Representative Results

Este método proporciona imágenes de contraste de fase, fluorescente rojo (colorante permeable a la membrana) y fluorescente verde (colorante impermeable a la membrana) tomadas en cada punto de tiempo. Junto con el proceso de formación de NET, se observan cambios morfológicos en el contraste de fase y en las imágenes fluorescentes rojas, y una vez que se rompe la membrana, se puede observar fluorescencia verde (Figura 1). En este ensayo, los neutrófilos formadores de NET son generalment…

Discussion

Los métodos actuales para cuantificar los NETs ex vivo tienen varios inconvenientes que limitan nuestra capacidad para estudiar neutrófilos, NETs y potenciales dianas terapéuticas de forma imparcial y de alto rendimiento^10,14. Por ejemplo, el recuento directo de células formadoras de NET después de la tinción inmunofluorescente, considerado el estándar de oro para la cuantificación de NET, es de bajo rendimiento y depende de la visión subjetiva …

Materials

AKT inhibitor	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye	Thermo Fisher Scientific	S7020
Nuclear red dye	Enzo	ENZ-52406	Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Phenol red containig RPMI can be used.