טכניקת תפוקה גבוהה בזמן אמת לכימות היווצרות מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים בנויטרופילים אנושיים
Summary
אנו מציגים שיטה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לכימות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) באמצעות מערכת ניתוח תאים חיים, יחד עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה.
Abstract
נויטרופילים הם תאים משושלת מיאלואידית המהווים חלק חיוני של מערכת החיסון המולדת. העשור האחרון חשף תפקידי מפתח נוספים שנויטרופילים ממלאים בפתוגנזה של סרטן, מחלות אוטואימוניות ומצבים דלקתיים חריפים וכרוניים שונים, בכך שהם תורמים לייזום ולהנצחה של חוסר ויסות חיסוני באמצעות מנגנונים מרובים, כולל היווצרות מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs), שהם מבנים חיוניים להגנה אנטי-מיקרוביאלית. מגבלות בטכניקות לכימות היווצרות רשת באופן בלתי מוטה, ניתן לשחזור ויעיל הגבילו את יכולתנו להבין עוד יותר את תפקידם של נויטרופילים בבריאות ובמחלות. אנו מתארים שיטה אוטומטית, בזמן אמת ובתפוקה גבוהה לכימות נויטרופילים העוברים היווצרות רשת באמצעות פלטפורמת הדמיה של תאים חיים בשילוב עם גישת צבע כפול תלוית חדירות ממברנה, תוך שימוש בשני צבעי דנ”א שונים כדי לדמיין דנ”א תוך-תאי וחוץ-תאי. מתודולוגיה זו מסוגלת לסייע בהערכת הפיזיולוגיה של הנויטרופילים ולבדוק מולקולות שיכולות להתמקד בהיווצרות רשת.
Introduction
מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) הן מבני כרומטין דמויי רשת שנפלטים מנויטרופילים בתגובה לגירויים דלקתיים שונים. NETs מורכבים מדנ”א, היסטונים וחלבונים/פפטידים אנטי-מיקרוביאליים שונים, אשר לוכדים והורגים פתוגנים זיהומיים ומעוררים תגובות דלקתיות1.
בעוד NETs מועילים להגנה על המארח מפני פתוגנים, הם צברו תשומת לב כמניע פוטנציאלי של מחלות אוטואימוניות שונות2, פקקת3, מחלות מטבוליות4, וצמיחה גרורתית של סרטן5. ככזה, עיכוב של היווצרות NET הוא אופציה טיפולית פוטנציאלית עבור מחלות אלה. עם זאת, למרות כמה מולקולות מכוונות NETs מבטיחות בפיתוח6, עדיין אין טיפול מאושר המשפיע באופן ספציפי על מנגנון זה. ניתן לייחס זאת, לפחות חלקית, להיעדר שיטות כימות אובייקטיביות, בלתי מוטות, ניתנות לשחזור ובעלות תפוקה גבוהה ליצירת NET.
הקמנו ודיווחנו על שיטה חדשה המשתמשת בפלטפורמת דימות תאים חיים בצבע כפול 7,8. תמונות בהילוך מהיר של נויטרופילים מוכתמים בצבע גרעיני חדיר לקרום וצבע DNA בלתי חדיר לקרום מנותחות על ידי התוכנה, ומספרי הנויטרופילים לפני ואחרי יצירת NET נספרים במספר נקודות זמן. מאחר ששלמות קרום הפלזמה אובדת במהלך היווצרות הרשת על ידי ויסות פירוק לאמין B בתיווך PKCα ולאמין 9 בתיווך CDK4/6, נויטרופילים יוצרי NET מוכתמים על ידי צבע DNA אטום לקרום בעוד נויטרופילים בריאים אינם. שיטה זו מתגברת על הבעיות של טכניקות שדווחו בעבר לכימות היווצרות NET ומספקת כימות NET בלתי מוטה, תפוקה גבוהה, ניתנת לשחזור ומדויקת באופן אוטומטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
לשיטות הנוכחיות לכימות NETs ex vivo יש מספר חסרונות המגבילים את יכולתנו לחקור נויטרופילים, NETs ומטרות טיפוליות פוטנציאליות באופן בלתי משוחד ובתפוקה גבוהה10,14. לדוגמה, ספירה ישירה של תאים יוצרי NET לאחר צביעה אימונופלואורסצנטית, הנחשבת לתקן הזהב לכימות NETs, היא …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למדור דימות אור במשרד המדע והטכנולוגיה במכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר Intramural של המכון הלאומי לדלקת פרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות (ZIA AR041199).
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
