Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Summary

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Abstract

Os neutrófilos são células de linhagem mieloide que formam uma parte crucial do sistema imune inato. A última década revelou papéis chave adicionais que os neutrófilos desempenham na patogênese do câncer, doenças autoimunes e várias condições inflamatórias agudas e crônicas, contribuindo para o início e perpetuação da desregulação imunológica por meio de múltiplos mecanismos, incluindo a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs), que são estruturas cruciais na defesa antimicrobiana. Limitações nas técnicas para quantificar a formação de NET de forma imparcial, reprodutível e eficiente têm restringido nossa capacidade de entender melhor o papel dos neutrófilos na saúde e nas doenças. Descrevemos um método automatizado, em tempo real e de alto rendimento para quantificar neutrófilos submetidos à formação de NET usando uma plataforma de imagem de células vivas acoplada a uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana usando dois corantes de DNA diferentes para obter imagens de DNA intracelular e extracelular. Essa metodologia é capaz de ajudar a avaliar a fisiologia dos neutrófilos e testar moléculas que podem ter como alvo a formação de NET.

Introduction

Armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são estruturas de cromatina semelhantes a teias extrudadas de neutrófilos em resposta a vários estímulos inflamatórios. As NETs são compostas por DNA, histonas e várias proteínas/peptídeos antimicrobianos, que aprisionam e matam patógenos infecciosos e invocam respostas inflamatórias¹.

Embora os TNEs sejam benéficos para a defesa do hospedeiro contra patógenos, eles têm chamado a atenção como um potencial impulsionador de várias doenças autoimunes², trombose³, doenças metabólicas⁴ e crescimento metastático de cânceres⁵. Como tal, a inibição da formação de NET é uma opção terapêutica potencial para estas doenças. No entanto, apesar de algumas moléculas promissoras de TNEs terem como alvo em desenvolvimento⁶, ainda não há uma terapia aprovada que afete especificamente esse mecanismo. Isso é, pelo menos parcialmente, atribuível à falta de métodos de quantificação objetivos, imparciais, reprodutíveis e de alto rendimento para a formação de NET.

Estabelecemos e relatamos um novo método utilizando uma plataforma de imagem de células vivas de duas cores ^7,8. Imagens de lapso de tempo de neutrófilos corados com corante nuclear permeável à membrana e corante de DNA impermeável à membrana são analisadas pelo software, e os números de neutrófilos pré e pós-formadores de NETs são contados em vários pontos de tempo. Uma vez que a integridade da membrana plasmática é perdida durante a formação de NET pela regulação da desmontagem de Lamin B mediada por PKCα e Lamin A/C mediada por CDK4/6⁹, os neutrófilos formadores de NET são corados por corante de DNA impermeável à membrana, enquanto os neutrófilos saudáveis não o são. Esse método supera os problemas das técnicas relatadas anteriormente para quantificar a formação de NET e fornece quantificação de NET imparcial, de alto rendimento, reprodutível e precisa de maneira automatizada.

Protocol

Os neutrófilos de indivíduos humanos saudáveis foram obtidos após o consentimento informado fornecido de acordo com o protocolo aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do National Institutes of Health (NIH). O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana do NIH. 1. Coloração dos neutrófilos e preparação da placa de ensaio Tomar sangue periférico com consentimento informado por escrito apropriado, seguindo as diretrize…

Representative Results

Este método fornece contraste de fase, imagens fluorescentes vermelhas (corante permeável à membrana) e fluorescentes verdes (corante impermeável à membrana) tiradas em cada ponto de tempo. Juntamente com o processo de formação da NET, observam-se alterações morfológicas nas imagens de contraste de fase e fluorescentes vermelhas e, uma vez rompida a membrana, pode-se observar fluorescência verde (Figura 1). Neste ensaio, os neutrófilos formadores de NET são geralmente redondos, …

Discussion

Os métodos atuais para quantificar NETs ex vivo têm várias desvantagens que limitam nossa capacidade de estudar neutrófilos, NETs e potenciais alvos terapêuticos de forma imparcial e de alto rendimento^10,14. Por exemplo, a contagem direta de células formadoras de NETs após a coloração por imunofluorescência, considerada o padrão-ouro para quantificação de NETs, é de baixo rendimento e dependente da visão subjetiva do operador. Um ensaio em…

Materials

AKT inhibitor	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye	Thermo Fisher Scientific	S7020
Nuclear red dye	Enzo	ENZ-52406	Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Phenol red containig RPMI can be used.