Real-time High Throughput-techniek om de vorming van extracellulaire neutrofielen in menselijke neutrofielen te kwantificeren
Summary
We presenteren een geautomatiseerde high-throughput methode om neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s) te kwantificeren met behulp van het live cell analysesysteem, gekoppeld aan een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering.
Abstract
Neutrofielen zijn myeloïde afstammingscellen die een cruciaal onderdeel vormen van het aangeboren immuunsysteem. Het afgelopen decennium heeft extra sleutelrollen aan het licht gebracht die neutrofielen spelen in de pathogenese van kanker, auto-immuunziekten en verschillende acute en chronische ontstekingsaandoeningen door bij te dragen aan het initiëren en bestendigen van immuunontregeling via meerdere mechanismen, waaronder de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s), die structuren zijn die cruciaal zijn voor antimicrobiële afweer. Beperkingen in technieken om NET-vorming op een onbevooroordeelde, reproduceerbare en efficiënte manier te kwantificeren, hebben ons vermogen beperkt om de rol van neutrofielen in gezondheid en ziekten beter te begrijpen. We beschrijven een geautomatiseerde, real-time, high-throughput methode om neutrofielen te kwantificeren die NET-vorming ondergaan met behulp van een live cell imaging platform in combinatie met een membraanpermeabiliteit-afhankelijke dual-dye benadering met behulp van twee verschillende DNA-kleurstoffen om intracellulair en extracellulair DNA in beeld te brengen. Deze methodologie kan helpen bij het beoordelen van de fysiologie van neutrofielen en het testen van moleculen die zich kunnen richten op NET-vorming.
Introduction
Neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s) zijn webachtige chromatinestructuren die uit neutrofielen worden geëxtrudeerd als reactie op verschillende ontstekingsstimuli. NET’s zijn samengesteld uit DNA, histonen en verschillende antimicrobiële eiwitten/peptiden, die infectieuze ziekteverwekkers vangen en doden en ontstekingsreacties oproepen.
Hoewel NET’s gunstig zijn voor de verdediging van de gastheer tegen ziekteverwekkers, hebben ze de aandacht getrokken als een potentiële aanjager van verschillende auto-immuunziekten2, trombose3, stofwisselingsziekten4 en gemetastaseerde groei van kankers5. Als zodanig is remming van NET-vorming een potentiële therapeutische optie voor deze ziekten. Ondanks enkele veelbelovende NET-gerichte moleculen in ontwikkeling6, is er nog steeds geen goedgekeurde therapie die specifiek op dit mechanisme van invloed is. Dit is, althans gedeeltelijk, toe te schrijven aan het ontbreken van objectieve, onbevooroordeelde, reproduceerbare en kwantificeringsmethoden met een hoge doorvoer voor NET-vorming.
We hebben een nieuwe methode ontwikkeld en gerapporteerd met behulp van een tweekleurig live-cell beeldvormingsplatform 7,8. Time-lapse-beelden van neutrofielen gekleurd met membraandoorlatende nucleaire kleurstof en membraanondoordringbare DNA-kleurstof worden geanalyseerd door de software en het aantal pre- en post-NET-vormende neutrofielen wordt op meerdere tijdstippen geteld. Aangezien de integriteit van het plasmamembraan verloren gaat tijdens NET-vorming door de regulatie van PKCα-gemedieerde Lamin B- en CDK4/6-gemedieerde Lamin A/C-demontage9, worden NET-vormende neutrofielen gekleurd door membraanondoordringbare DNA-kleurstof, terwijl gezonde neutrofielen dat niet zijn. Deze methode lost de problemen op van eerder gerapporteerde technieken om NET-vorming te kwantificeren en biedt onbevooroordeelde, high-throughput, reproduceerbare en nauwkeurige NET-kwantificering op een geautomatiseerde manier.
Protocol
Representative Results
Discussion
De huidige methoden om NET’s ex vivo te kwantificeren hebben verschillende nadelen die ons vermogen beperken om neutrofielen, NET’s en potentiële therapeutische doelen op een onbevooroordeelde en high-throughput manier te bestuderen10,14. Het direct tellen van NET-vormende cellen na immunofluorescerende kleuring, dat wordt beschouwd als de gouden standaard voor het kwantificeren van NET’s, heeft bijvoorbeeld een lage doorvoer en is afhankelijk van de su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken de Light Imaging Section van het Office of Science and Technology van het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health. Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramural Research Program van het National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases van de National Institutes of Health (ZIA AR041199).
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
