实时高通量技术量化人中性粒细胞中性粒细胞胞外陷阱的形成

Summary

我们提出了一种自动化的高通量方法，利用活细胞分析系统与膜通透性依赖性双染料方法相结合，对中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 进行定量。

Abstract

中性粒细胞是髓系细胞，是先天免疫系统的重要组成部分。过去十年揭示了中性粒细胞在癌症、自身免疫性疾病和各种急性和慢性炎症性疾病的发病机制中发挥的额外关键作用，通过多种机制促进免疫失调的启动和持续，包括中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 的形成，这是抗菌防御的关键结构。以无偏倚、可重复和有效的方式量化 NET 形成的技术的局限性限制了我们进一步了解中性粒细胞在健康和疾病中的作用的能力。我们描述了一种自动化、实时、高通量的方法，该方法使用活细胞成像平台与膜通透性依赖性双染料方法相结合，使用两种不同的 DNA 染料对细胞内和细胞外 DNA 进行成像。该方法能够帮助评估中性粒细胞生理学并测试可以靶向 NET 形成的分子。

Introduction

中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 是响应各种炎症刺激而从中性粒细胞挤出的网状染色质结构。神经内分泌瘤由 DNA、组蛋白和各种抗菌蛋白/肽组成，可捕获和杀死传染性病原体并引发炎症反应¹。

虽然神经内分泌瘤有利于宿主防御病原体，但它们作为各种自身免疫性疾病²、血栓形成³、代谢疾病⁴ 和癌症转移性生长⁵ 的潜在驱动因素而受到关注。因此，抑制神经内分泌瘤的形成是这些疾病的潜在治疗选择。然而，尽管一些有前途的 NET 靶向分子正在开发^{中 6}，但仍然没有批准的疗法专门影响这种机制。这至少部分归因于缺乏客观、无偏倚、可重现和高通量的 NET 形成定量方法。

我们建立并报道了一种利用双色活细胞成像平台^{的新方法7,8}。通过软件分析膜渗透性核染料和膜渗透性DNA染料染色的中性粒细胞的延时图像，并在多个时间点计算NET形成前和形成后中性粒细胞的数量。由于在 NET 形成过程中，由于 PKCα 介导的 Lamin B 和 CDK4/6 介导的 Lamin A/C 分解的调节会失去质膜的完整性⁹，因此形成 NET 的中性粒细胞被膜不可渗透的 DNA 染料染色，而健康的中性粒细胞则不会。该方法克服了先前报道的定量 NET 形成技术的问题，并以自动化方式提供无偏、高通量、可重现和准确的 NET 定量。

Protocol

根据美国国立卫生研究院 （NIH） 机构审查委员会 （IRB） 批准的方案提供知情同意后，获得来自健康人类受试者的中性粒细胞。该协议遵循 NIH 人类研究伦理委员会的指导方针。 1.中性粒细胞的染色和测定板的制备 按照每个研究所的指南在适当的书面知情同意书下采集外周血，并使用任何所需的方法分离中性粒细胞。例如，Ficoll-葡聚糖方法1…

Representative Results

该方法提供在每个时间点拍摄的相差、红色荧光（透膜染料）和绿色荧光（膜不渗透染料）图像。随着NET形成过程，在相差和红色荧光图像中观察到形态变化，一旦膜被破坏，就可以观察到绿色荧光（图1）。在该测定中，形成NET的中性粒细胞通常是圆形的，而不是形成网状结构。这是因为机器的分辨率不够高，无法捕获细小的网状结构和膜不透水的绿色染料，一旦膜被破坏…

Discussion

目前离体量化NETs的方法有几个缺点，限制了我们以无偏倚和高通量的方式研究中性粒细胞、NETs和潜在治疗靶点^{的能力10,14}。例如，免疫荧光染色后直接计数 NET 形成细胞，被认为是定量 NET 的金标准，但通量低，取决于操作者的主观观点。检测膜不可渗透DNA染料荧光的平板测定法以客观和高通量的方式定量细胞外DNA作为NET的替代标记物，但由于该…

Materials

AKT inhibitor	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye	Thermo Fisher Scientific	S7020
Nuclear red dye	Enzo	ENZ-52406	Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Phenol red containig RPMI can be used.