Tecnica real-time ad alto rendimento per quantificare la formazione di trappole extracellulari di neutrofili nei neutrofili umani

Summary

Presentiamo un metodo automatizzato ad alto rendimento per quantificare le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) utilizzando il sistema di analisi delle cellule vive, accoppiato con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana.

Abstract

I neutrofili sono cellule di linea mieloide che costituiscono una parte cruciale del sistema immunitario innato. L’ultimo decennio ha rivelato ulteriori ruoli chiave che i neutrofili svolgono nella patogenesi del cancro, delle malattie autoimmuni e di varie condizioni infiammatorie acute e croniche, contribuendo all’inizio e alla perpetuazione della disregolazione immunitaria attraverso molteplici meccanismi, tra cui la formazione di trappole extracellulari per neutrofili (NET), che sono strutture cruciali nella difesa antimicrobica. I limiti delle tecniche per quantificare la formazione di NET in modo imparziale, riproducibile ed efficiente hanno limitato la nostra capacità di comprendere ulteriormente il ruolo dei neutrofili nella salute e nelle malattie. Descriviamo un metodo automatizzato, in tempo reale e ad alto rendimento per quantificare i neutrofili sottoposti a formazione di NET utilizzando una piattaforma di imaging di cellule vive accoppiata con un approccio a doppio colorante dipendente dalla permeabilità della membrana che utilizza due diversi coloranti di DNA per visualizzare il DNA intracellulare ed extracellulare. Questa metodologia è in grado di aiutare a valutare la fisiologia dei neutrofili e testare molecole in grado di colpire la formazione di NET.

Introduction

Le trappole extracellulari dei neutrofili (NET) sono strutture di cromatina simili a ragnatele estruse dai neutrofili in risposta a vari stimoli infiammatori. I NET sono composti da DNA, istoni e varie proteine/peptidi antimicrobici, che intrappolano e uccidono gli agenti patogeni infettivi e invocano risposte infiammatorie¹.

Sebbene i NET siano utili per la difesa dell’ospite contro gli agenti patogeni, hanno attirato l’attenzione come potenziale motore di varie malattie autoimmuni², trombosi³, malattie metaboliche⁴ e crescita metastatica dei tumori⁵. In quanto tale, l’inibizione della formazione di NET è una potenziale opzione terapeutica per queste malattie. Tuttavia, nonostante alcune promettenti molecole mirate ai NET in fase di sviluppo⁶, non esiste ancora una terapia approvata che influisca specificamente su questo meccanismo. Ciò è, almeno in parte, attribuibile alla mancanza di metodi di quantificazione oggettivi, imparziali, riproducibili e ad alto rendimento per la formazione di NET.

Abbiamo stabilito e segnalato un nuovo metodo che utilizza una piattaforma di imaging a due colori su cellule vive ^7,8. Le immagini time-lapse di neutrofili colorati con colorante nucleare permeabile alla membrana e colorante DNA impermeabile alla membrana vengono analizzate dal software e il numero di neutrofili pre e post-formazione di NET viene conteggiato in più punti temporali. Poiché l’integrità della membrana plasmatica viene persa durante la formazione di NET dalla regolazione del^{disassemblaggio} della lamina B mediata da PKCα e della lamina A/C mediata da CDK4/6 CDK4/6 9, i neutrofili che formano NET sono colorati da un colorante di DNA impermeabile alla membrana, mentre i neutrofili sani non lo sono. Questo metodo supera i problemi delle tecniche precedentemente riportate per quantificare la formazione di NET e fornisce una quantificazione imparziale, ad alto rendimento, riproducibile e accurata di NET in modo automatizzato.

Protocol

I neutrofili da soggetti umani sani sono stati ottenuti dopo che il consenso informato è stato fornito secondo il protocollo approvato dall’Institutional Review Board (IRB) del National Institutes of Health (NIH). Il protocollo segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana del NIH. 1. Colorazione dei neutrofili e preparazione della piastra di analisi Prelevare il sangue periferico con un adeguato consenso informato scritto seguendo le linee guida di c…

Representative Results

Questo metodo fornisce immagini a contrasto di fase, fluorescenti rosse (colorante permeabile alla membrana) e fluorescenti verdi (colorante impermeabile alla membrana) scattate in ogni punto temporale. Insieme al processo di formazione del NET, si osservano cambiamenti morfologici nelle immagini a contrasto di fase e fluorescenti rosse e, una volta violata la membrana, si può osservare la fluorescenza verde (Figura 1). In questo saggio, i neutrofili che formano NET sono generalmente rotond…

Discussion

Gli attuali metodi per quantificare i NET ex vivo presentano diversi inconvenienti che limitano la nostra capacità di studiare neutrofili, NET e potenziali bersagli terapeutici in modo imparziale e ad alto rendimento^10,14. Ad esempio, il conteggio diretto delle cellule che formano NET dopo la colorazione immunofluorescente, considerato il gold standard per la quantificazione dei NET, è a basso rendimento e dipende dalla visione soggettiva dell’operator…

Materials

AKT inhibitor	Calbiochem	124028
Clear 96-well plate	Corning	3596
Live cell analysis system	Sartorius	N/A	Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye	Thermo Fisher Scientific	S7020
Nuclear red dye	Enzo	ENZ-52406	Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI	Thermo Fisher Scientific	11835030	Phenol red containig RPMI can be used.