Aquí se proporciona un protocolo detallado para establecer organoides mamarios humanos a partir de resecciones de tumores de mama derivados de pacientes o tejido mamario normal. El protocolo proporciona instrucciones completas paso a paso para el cultivo, la congelación y la descongelación de organoides mamarios derivados de pacientes humanos.
El cáncer de mama es una enfermedad compleja que se ha clasificado en varios subtipos histológicos y moleculares diferentes. Los organoides tumorales de mama derivados de pacientes desarrollados en nuestro laboratorio consisten en una mezcla de múltiples poblaciones de células derivadas de tumores y, por lo tanto, representan una mejor aproximación de la diversidad y el entorno de las células tumorales que las líneas celulares de cáncer 2D establecidas. Los organoides sirven como un modelo ideal in vitro , lo que permite las interacciones célula-matriz extracelular, que se sabe que desempeñan un papel importante en las interacciones célula-célula y la progresión del cáncer. Los organoides derivados de pacientes también tienen ventajas sobre los modelos de ratón, ya que son de origen humano. Además, se ha demostrado que recapitulan la heterogeneidad genómica, transcriptómica y metabólica de los tumores de los pacientes; Por lo tanto, son capaces de representar la complejidad tumoral, así como la diversidad del paciente. Como resultado, están preparados para proporcionar información más precisa sobre el descubrimiento y la validación de objetivos y los ensayos de sensibilidad a los medicamentos. En este protocolo, proporcionamos una demostración detallada de cómo se establecen los organoides mamarios derivados de pacientes a partir de tumores de mama resecados (organoides de cáncer) o tejido mamario derivado de la mamoplastia reductora (organoides normales). Esto es seguido por una descripción completa del cultivo de organoides 3D, expansión, paso, congelación, así como la descongelación de cultivos de organoides mamarios derivados de pacientes.
El cáncer de mama (CB) es la neoplasia maligna más común en las mujeres, con 287,850 nuevos casos estimados para ser diagnosticados en los Estados Unidos en 20221. A pesar de los recientes avances en la detección temprana con exámenes anuales, terapias dirigidas y una mejor comprensión de la predisposición genética, prevalece como la segunda causa principal de muertes por cáncer en mujeres en los Estados Unidos, con > 40,000 muertes atribuidas al cáncer de mama anualmente1. El cáncer de mama se clasifica actualmente en múltiples subtipos basados en la evaluación histopatológica y molecular del tumor primario. Una mejor estratificación del subtipo ha mejorado los resultados de los pacientes con opciones de tratamiento específicas del subtipo2. Por ejemplo, la identificación de HER2 como protooncogén3 ha llevado al desarrollo de Trastuzumab, lo que ha hecho que este subtipo altamente agresivo sea manejable en la mayoría de los pacientes4. La investigación adicional sobre la genética y la transcriptómica de esta enfermedad compleja de una manera específica del paciente ayudará a desarrollar y predecir mejores regímenes de tratamiento personalizados específicos para el paciente 2,5. Los organoides derivados de pacientes (DOP) son un nuevo modelo prometedor para obtener información sobre el cáncer a nivel molecular, identificar nuevos objetivos o biomarcadores y diseñar nuevas estrategias de tratamiento 6,7,8.
Las DOP son estructuras multicelulares tridimensionales (3D) derivadas de muestras de tejido primario recién resecadas 8,9. Se cultivan tridimensionalmente al estar incrustados en una matriz de hidrogel, típicamente compuesta de una combinación de proteínas de matriz extracelular (ECM) y, por lo tanto, se pueden usar para estudiar las interacciones entre células tumorales y ECM. Las PDO representan la diversidad del paciente y recapitulan la heterogeneidad celular y las características genéticas del tumor10,11,12. Al ser modelos in vitro, permiten la manipulación genética y el cribado de fármacos de alto rendimiento13,14,15. Además, las PDO se pueden utilizar de manera plausible para evaluar la sensibilidad a los medicamentos y las estrategias de tratamiento del paciente en paralelo a la clínica y ayudar a predecir los resultados de los pacientes16,17,18. Además de la quimioterapia, también se han utilizado ciertos modelos de organoides para examinar las respuestas individuales de los pacientes a la quimiorradiación19,20. Dada la prometedora aplicabilidad de las PDO para la investigación y el uso clínico, el Instituto Nacional del Cáncer ha iniciado un consorcio internacional, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, para generar y proporcionar estos nuevos modelos de cáncer derivados de tumores. Muchos de los modelos organoides de varios tipos de cáncer desarrollados a través del HCMI están disponibles a través de la American Type Culture Collection (ATCC)22.
Se ha demostrado que los organoides normales de mama están compuestos por diferentes poblaciones de células epiteliales presentes en la glándula mamaria 11,23 y, por lo tanto, sirven como excelentes modelos para estudiar procesos biológicos básicos, analizar mutaciones impulsoras que causan tumorigénesis y estudios de linaje de células cancerosas de origen 6,15 . Se han utilizado modelos de organoides tumorales de mama para identificar nuevas dianas que son alentadoras perspectivas para el desarrollo de nuevas terapias, en particular para tumores resistentes24,25,26. Utilizando xenoinjertos derivados del paciente (PDX) y modelos organoides derivados de PDX (PDxO) emparejados de tumores de mama resistentes al tratamiento, Guillén et al. demostraron que los organoides son modelos poderosos para la medicina de precisión, que pueden aprovecharse para evaluar las respuestas a los medicamentos y las decisiones de terapia directa de manera paralela28. Además, el desarrollo de nuevos métodos de cocultivo para el cultivo de PDOs con diversas células inmunes27,28,29, fibroblastos 30,31 y microbios 32,33 presenta una oportunidad para estudiar el impacto del microambiente tumoral en la progresión del cáncer. Si bien muchos de estos métodos de cocultivo se están estableciendo activamente para las PDO derivadas de tumores pancreáticos o colorrectales, solo se han informado métodos similares de cocultivo establecidos para las PDO de mama para las células asesinas naturales34 y los fibroblastos35.
El primer biobanco de >100 organoides derivados de pacientes que representan diferentes subtipos de cáncer de mama fue desarrollado por el grupo Hans Clevers36,37. Como parte de este esfuerzo, el grupo Clevers también desarrolló el primer medio de cultivo complejo para el crecimiento de organoides mamarios, que actualmente es ampliamente utilizado36. Un estudio de seguimiento proporcionó una descripción exhaustiva del establecimiento y cultivo de DOP mamarias y xenoinjertos organoides derivados de pacientes (PDOX)38. El laboratorio de Welm desarrolló una gran colección de modelos BC PDX y PDxOs que se cultivan en un medio de crecimiento comparativamente más simple que contiene suero bovino fetal (FBS) y menos factores de crecimiento39,40. Hemos desarrollado y caracterizado de forma independiente una gran variedad de modelos organoides de cáncer de mama naïve derivados de pacientes11, y hemos participado en el desarrollo de modelos BC PDO como parte de la iniciativa HCMI21. Aquí, nuestro objetivo es proporcionar una guía práctica que detalle la metodología empleada por nosotros en la generación de sistemas de modelos de organoides mamarios derivados de pacientes.
Nuestro laboratorio ha empleado con éxito los protocolos anteriores para establecer organoides a partir de resecciones o raspados tumorales ingenuos. También hemos utilizado este protocolo para desarrollar organoides normales a partir de tejido mamario obtenido a través de mamoplastias reductoras o de tejido mamario normal adyacente o distal de pacientes con cáncer. Alrededor de 30 a 40 % de los tumores primarios resecados dieron lugar a cultivos de organoides tumorales exitosos a largo plazo (paso 8 >). Las…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio Spector por las discusiones críticas a lo largo de este trabajo. Agradecemos a Norman Sachs y Hans Clevers (Hubrecht Institute, Países Bajos) por proporcionarnos inicialmente su protocolo de cultivo de organoides. Reconocemos los Recursos Compartidos de Histología y Microscopía del Centro Oncológico de CSHL por sus servicios y experiencia técnica (NCI 2P3OCA45508). Agradecemos al Dr. Qing Gao por su ayuda con la preparación de muestras histológicas. Estamos agradecidos por el apoyo de la Dra. Karen Kostroff (Northwell Health) por proporcionar muestras de tumores de pacientes. También apreciamos los esfuerzos del equipo de Northwell Health Biobanking para la adquisición de muestras, y agradecemos a los pacientes y sus familias por donar tejidos para la investigación. Esta investigación fue apoyada por CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) y Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson y D.L.S).
15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
37 °C bead bath | |||
37 °C CO2 incubator | |||
50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
Parafilm | transparent film | ||
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |