Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt voor het vaststellen van menselijke borstorganoïden uit van de patiënt afgeleide borsttumorresecties of normaal borstweefsel. Het protocol biedt uitgebreide stapsgewijze instructies voor het kweken, bevriezen en ontdooien van menselijke patiënten afgeleide borstorganoïden.
Borstkanker is een complexe ziekte die is ingedeeld in verschillende histologische en moleculaire subtypen. Patiënt-afgeleide borsttumor organoïden ontwikkeld in ons laboratorium bestaan uit een mix van meerdere tumor-afgeleide celpopulaties, en vertegenwoordigen dus een betere benadering van tumorceldiversiteit en -milieu dan de gevestigde 2D-kankercellijnen. Organoïden dienen als een ideaal in vitro model, waardoor cel-extracellulaire matrixinteracties mogelijk zijn, waarvan bekend is dat ze een belangrijke rol spelen in cel-celinteracties en kankerprogressie. Patiënt-afgeleide organoïden hebben ook voordelen ten opzichte van muismodellen omdat ze van menselijke oorsprong zijn. Bovendien is aangetoond dat ze de genomische, transcriptomische en metabole heterogeniteit van patiënttumoren samenvatten; Ze zijn dus in staat om tumorcomplexiteit en patiëntendiversiteit weer te geven. Als gevolg hiervan zijn ze klaar om nauwkeuriger inzicht te bieden in de ontdekking en validatie van doelen en gevoeligheidstests voor geneesmiddelen. In dit protocol geven we een gedetailleerde demonstratie van hoe patiënt-afgeleide borstorganoïden worden vastgesteld uit gereseceerde borsttumoren (kankerorganoïden) of reductief mammoplastiek-afgeleid borstweefsel (normale organoïden). Dit wordt gevolgd door een uitgebreid verslag van 3D-organoïdecultuur, expansie, passaging, bevriezing en ontdooiing van van de patiënt afgeleide borstorganoïde culturen.
Borstkanker (BC) is de meest voorkomende maligniteit bij vrouwen, met naar schatting 287.850 nieuwe gevallen die in 2022 in de Verenigde Staten worden gediagnosticeerd1. Ondanks de recente vooruitgang in vroege detectie met jaarlijkse screenings, gerichte therapieën en een beter begrip van genetische aanleg, is het de tweede belangrijkste oorzaak van sterfgevallen door kanker bij vrouwen in de Verenigde Staten, met > 40.000 sterfgevallen toegeschreven aan borstkankerper jaar 1. Borstkanker wordt momenteel ingedeeld in meerdere subtypen op basis van histopathologische en moleculaire evaluatie van de primaire tumor. Betere subtypestratificatie heeft de patiëntresultaten verbeterd met subtypespecifieke behandelingsopties2. De identificatie van HER2 als een proto-oncogen3 heeft bijvoorbeeld geleid tot de ontwikkeling van Trastuzumab, waardoor dit zeer agressieve subtype bij de meeste patiënten beheersbaar is geworden4. Verder onderzoek naar de genetica en transcriptomica van deze complexe ziekte op een patiëntspecifieke manier zal helpen bij het ontwikkelen en voorspellen van betere patiëntspecifieke gepersonaliseerde behandelingsregimes 2,5. Patiënt-afgeleide organoïden (BOB’s) zijn een veelbelovend nieuw model om inzicht te krijgen in kanker op moleculair niveau, nieuwe doelen of biomarkers te identificeren en nieuwe behandelingsstrategieën te ontwerpen 6,7,8.
BOB’s zijn meercellige, driedimensionale (3D) structuren die zijn afgeleid van vers gereseceerde primaire weefselmonsters 8,9. Ze worden driedimensionaal gekweekt door ingebed te zijn in een hydrogelmatrix, meestal samengesteld uit een combinatie van extracellulaire matrix (ECM) -eiwitten, en kunnen daarom worden gebruikt om tumorcel-ECM-interacties te bestuderen. BOB’s vertegenwoordigen de diversiteit van de patiënt en recapituleren cellulaire heterogeniteit en genetische kenmerken van de tumor10,11,12. Omdat het in vitro modellen zijn, maken ze genetische manipulatie en high-throughput medicijnscreeningsmogelijk 13,14,15. Verder kunnen BOB’s plausibel worden gebruikt om de gevoeligheid en behandelingsstrategieën van patiënten parallel aan de kliniek te evalueren en de uitkomsten van de patiënt te helpen voorspellen16,17,18. Naast chemotherapie zijn bepaalde organoïde modellen ook gebruikt om individuele reacties van patiënten op chemoradiatiete onderzoeken 19,20. Gezien de veelbelovende toepasbaarheid van BOB’s voor onderzoek en klinisch gebruik, heeft het National Cancer Institute een internationaal consortium geïnitieerd, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, om deze van tumoren afgeleide nieuwe kankermodellen te genereren en te leveren. Veel van de organoïde modellen van verschillende soorten kanker ontwikkeld via de HCMI zijn beschikbaar via de American Type Culture Collection (ATCC)22.
Van normale borstorganoïden is aangetoond dat ze bestaan uit verschillende epitheelcelpopulaties die aanwezig zijn in de borstklier 11,23 en dienen dus als geweldige modellen om fundamentele biologische processen te bestuderen, om drivermutaties te analyseren die tumorigenese veroorzaken, en voor kankercel-van-oorsprong afstammingsstudies 6,15 . Borsttumor organoïde modellen zijn gebruikt om nieuwe doelen te identificeren die de vooruitzichten voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën aanmoedigen, met name voor resistente tumoren24,25,26. Met behulp van patiënt-afgeleide xenograft (PDX) en gematchte PDX-afgeleide organoïde (PDxO) modellen van behandelingsresistente borsttumoren, toonden Guillen et al. aan dat organoïden krachtige modellen zijn voor precisiegeneeskunde, die kunnen worden gebruikt om medicijnresponsen en directe therapiebeslissingen parallel te evalueren28. Bovendien biedt de ontwikkeling van nieuwe co-cultuurmethoden voor het kweken van BOB’s met verschillende immuuncellen27,28,29, fibroblasten 30,31 en microben 32,33 een kans om de impact van de tumormicro-omgeving op kankerprogressie te bestuderen. Hoewel veel van dergelijke co-cultuurmethoden actief worden vastgesteld voor BOB’s die zijn afgeleid van pancreas- of colorectale tumoren, zijn vergelijkbare gevestigde co-cultuurmethoden voor borst-BOB’s alleen gemeld voor natural killer-cellen34 en fibroblasten35.
De eerste biobank van >100 patiënt-afgeleide organoïden die verschillende borstkankersubtypes vertegenwoordigen, werd ontwikkeld door de Hans Clevers-groep36,37. Als onderdeel van deze inspanning ontwikkelde de Clevers-groep ook het eerste complexe kweekmedium voor borstorganoïdegroei, dat momenteel veel wordt gebruikt36. Een vervolgstudie leverde een uitgebreid verslag op van de oprichting en kweek van borst-BOB’s en van patiënten afgeleide organoïde xenografts (PDOXs)38. Het Welm-lab ontwikkelde een grote verzameling BC PDX-modellen en PDxO’s die worden gekweekt in een relatief eenvoudiger groeimedium met foetaal runderserum (FBS) en minder groeifactoren39,40. We hebben onafhankelijk een groot aantal naïeve patiënt-afgeleide borstkanker organoïde modellen11 ontwikkeld en gekarakteriseerd en hebben deelgenomen aan de ontwikkeling van BC PDO-modellen als onderdeel van het HCMI-initiatief21. Hier willen we een praktische gids bieden met details over de methodologie die door ons wordt gebruikt bij het genereren van patiënt-afgeleide borstorganoïde modelsystemen.
Ons laboratorium heeft met succes de bovenstaande protocollen gebruikt om organoïden vast te stellen uit naïeve tumorresecties of schaafwonden. We hebben dit protocol ook gebruikt om normale organoïden te ontwikkelen uit borstweefsel verkregen via reductieve mammoplastieën of uit aangrenzend of distaal normaal borstweefsel van kankerpatiënten. Ongeveer 30%-40% van de gereseceerde primaire tumoren resulteerde in succesvolle langdurige (>passage 8) tumor organoïde culturen. De tumororganoïde lijnen die na e…
The authors have nothing to disclose.
We willen de leden van het Spector-lab bedanken voor de kritische discussies in de loop van dit werk. We bedanken Norman Sachs en Hans Clevers (Hubrecht Instituut, Nederland) voor het in eerste instantie verstrekken van hun organoïde kweekprotocol. We erkennen de CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources voor diensten en technische expertise (NCI 2P3OCA45508). Wij danken Dr. Qing Gao voor zijn hulp bij de voorbereiding van histologische monsters. We zijn dankbaar voor de steun van Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) voor het verstrekken van tumormonsters van patiënten. We waarderen ook de inspanningen van het Northwell Health Biobanking-team voor monsterverwerving en we bedanken de patiënten en hun families voor het doneren van weefsels voor onderzoek. Dit onderzoek werd ondersteund door CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.), en Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson en D.L.S).
15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
37 °C bead bath | |||
37 °C CO2 incubator | |||
50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
Parafilm | transparent film | ||
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |