يتم توفير بروتوكول مفصل هنا لإنشاء عضويات الثدي البشرية من استئصال ورم الثدي المشتق من المريض أو أنسجة الثدي الطبيعية. يوفر البروتوكول تعليمات شاملة خطوة بخطوة لزراعة وتجميد وإذابة عضويات الثدي البشرية المشتقة من المريض.
سرطان الثدي هو مرض معقد تم تصنيفه إلى عدة أنواع فرعية نسيجية وجزيئية مختلفة. تتكون عضويات أورام الثدي المشتقة من المريض التي تم تطويرها في مختبرنا من مزيج من مجموعات متعددة من الخلايا المشتقة من الورم ، وبالتالي تمثل تقاربا أفضل لتنوع الخلايا السرطانية وبيئتها من خطوط الخلايا السرطانية 2D المنشأة. تعمل المواد العضوية كنموذج مثالي في المختبر ، مما يسمح بتفاعلات المصفوفة الخلوية خارج الخلية ، والمعروفة بأنها تلعب دورا مهما في تفاعلات الخلايا وتطور السرطان. تتمتع الكائنات العضوية المشتقة من المريض أيضا بمزايا على نماذج الفئران لأنها من أصل بشري. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أنها تلخص عدم التجانس الجيني والنسخ وكذلك التمثيل الغذائي لأورام المرضى. وبالتالي ، فهي قادرة على تمثيل تعقيد الورم وكذلك تنوع المرضى. ونتيجة لذلك ، فإنهم مستعدون لتقديم رؤى أكثر دقة حول اكتشاف الهدف والتحقق من صحته ومقايسات حساسية الدواء. في هذا البروتوكول ، نقدم عرضا مفصلا لكيفية إنشاء عضويات الثدي المشتقة من المريض من أورام الثدي المقطوعة (عضويات السرطان) أو أنسجة الثدي المشتقة من عملية تجميل الثدي المختزلة (العضويات الطبيعية). ويتبع ذلك حساب شامل لثقافة 3D العضوية ، والتوسع ، والمرور ، والتجميد ، وكذلك ذوبان الثقافات العضوية للثدي المشتقة من المريض.
سرطان الثدي (BC) هو أكثر الأورام الخبيثة شيوعا بين الإناث ، حيث يقدر تشخيص 287,850 حالة جديدة في الولايات المتحدة في عام 20221. على الرغم من التطورات الحديثة في الكشف المبكر من خلال الفحوصات السنوية والعلاجات المستهدفة والفهم الأفضل للاستعداد الوراثي ، إلا أنه يسود ليكون السبب الرئيسي الثاني لوفيات السرطان لدى الإناث في الولايات المتحدة ، حيث تعزى >40,000 حالة وفاة إلى سرطان الثدي سنويا1. يصنف سرطان الثدي حاليا إلى أنواع فرعية متعددة بناء على التقييم النسيجي المرضي والجزيئي للورم الرئيسي. أدى التقسيم الطبقي الأفضل للنوع الفرعي إلى تحسين نتائج المرضى من خلال خيارات العلاج الخاصة بالنوع الفرعي2. على سبيل المثال ، أدى تحديد HER2 على أنه جين ورميأولي 3 إلى تطوير Trastuzumab ، مما جعل هذا النوع الفرعي شديد العدوانية قابلا للإدارة في معظم المرضى4. سيساعد إجراء مزيد من الأبحاث في علم الوراثة والنسخ لهذا المرض المعقد بطريقة خاصة بالمريض في تطوير أنظمة علاج شخصية أفضل خاصة بالمريض 2,5 والتنبؤ بها. تعد الكائنات العضوية المشتقة من المريض (PDOs) نموذجا جديدا واعدا لاكتساب نظرة ثاقبة للسرطان على المستوى الجزيئي ، وتحديد أهداف جديدة أو مؤشرات حيوية وتصميم استراتيجيات علاج جديدة6،7،8.
PDOs هي هياكل متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) مشتقة من عينات الأنسجة الأولية التي تم استئصالها حديثا 8,9. يتم زراعتها ثلاثية الأبعاد من خلال تضمينها في مصفوفة هيدروجيل ، تتكون عادة من مزيج من بروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة تفاعلات الخلايا السرطانية و ECM. تمثل PDOs تنوع المريض وتلخص عدم التجانس الخلوي والسمات الوراثية للورم10،11،12. كونها نماذج في المختبر ، فإنها تسمح بالتلاعب الجيني وشاشات الأدوية عالية الإنتاجية13،14،15. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام PDOs بشكل معقول لتقييم حساسية المريض للأدوية واستراتيجيات العلاج بالتوازي مع العيادة والمساعدة في التنبؤ بنتائج المرضى16،17،18. إلى جانب العلاج الكيميائي ، تم استخدام بعض النماذج العضوية أيضا لفحص استجابات المرضى الفردية للإشعاع الكيميائي19,20. نظرا للتطبيق الواعد ل PDOs للبحث والاستخدام السريري ، أنشأ المعهد الوطني للسرطان اتحادا دوليا ، مبادرة نماذج السرطان البشرية (HCMI) 21 ، لتوليد وتوفير نماذج السرطان الجديدة المشتقة من الورم. تتوفر العديد من النماذج العضوية لأنواع السرطان المختلفة التي تم تطويرها من خلال HCMI عبر مجموعة ثقافة النوع الأمريكية (ATCC) 22.
لقد ثبت أن عضويات الثدي الطبيعية تتكون من مجموعات مختلفة من الخلايا الظهارية الموجودة في الغدة الثديية 11,23 ، وبالتالي فهي بمثابة نماذج رائعة لدراسة العمليات البيولوجية الأساسية ، لتحليل الطفرات الدافعة التي تسبب تكوين الورم ، ولدراسات نسب الخلايا السرطانيةالأصلية 6,15 . تم استخدام النماذج العضوية لأورام الثدي لتحديد أهداف جديدة تشجع الآفاق لتطوير علاجات جديدة ، خاصة للأورام المقاومة24،25،26. باستخدام xenograft المشتق من المريض (PDX) والنماذج العضوية المشتقة من PDX (PDxO) المتطابقة لأورام الثدي المقاومة للعلاج ، أظهر Guillen et al. أن المواد العضوية هي نماذج قوية للطب الدقيق ، والتي يمكن الاستفادة منها لتقييم استجابات الأدوية وقرارات العلاج المباشر بالتوازي28. علاوة على ذلك ، فإن تطوير طرق جديدة للاستزراع المشترك لزراعة PDOs مع الخلايا المناعيةالمختلفة 27،28،29 ، والخلايا الليفية 30،31 والميكروبات32،33 يمثل فرصة لدراسة تأثير البيئة المكروية للورم على تطور السرطان. في حين يتم إنشاء العديد من طرق الاستزراع المشترك هذه بنشاط ل PDOs المشتقة من أورام البنكرياس أو القولون والمستقيم ، فقد تم الإبلاغ عن طرق زراعة مشتركة مماثلة ل PDOs للثدي فقط للخلايا القاتلة الطبيعية34 والخلايا الليفية35.
تم تطوير أول بنك حيوي من >100 عضوي مشتق من المريض يمثل أنواعا فرعية مختلفة من سرطان الثدي من قبل مجموعة Hans Clevers36,37. كجزء من هذا الجهد ، طورت مجموعة Clevers أيضا أول وسيط استزراع معقد لنمو عضويات الثدي ، والذي يستخدم حاليا على نطاق واسع36. قدمت دراسة متابعة سردا شاملا لتأسيس وثقافة PDOs الثدي والطعوم الخارجية العضوية المشتقة من المريض (PDOXs)38. طور مختبر Welm مجموعة كبيرة من نماذج BC PDX و PDxOs التي يتم استزراعها في وسط نمو أبسط نسبيا يحتوي على مصل بقري جنيني (FBS) وعوامل نمو أقل39,40. لقد طورنا وميزنا بشكل مستقل مجموعة كبيرة من النماذج العضوية لسرطان الثدي الساذجةالمشتقة من المريض 11 ، وشاركنا في تطوير نماذج BC PDO كجزء من مبادرة HCMI21. هنا ، نهدف إلى تقديم دليل عملي يوضح بالتفصيل المنهجية التي نستخدمها في إنشاء أنظمة نموذج عضوي للثدي مشتقة من المريض.
لقد استخدم مختبرنا بنجاح البروتوكولات المذكورة أعلاه لإنشاء مواد عضوية من عمليات استئصال الورم أو كشطه الساذجة. لقد استخدمنا هذا البروتوكول أيضا لتطوير عضويات طبيعية من أنسجة الثدي التي تم الحصول عليها عن طريق رأب الثدي المختزل أو من أنسجة الثدي الطبيعية المجاورة أو البعيدة لمرضى ا…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر أعضاء مختبر سبيكتور على المناقشات النقدية طوال هذا العمل. نشكر نورمان ساكس وهانز كليفرز (معهد هوبريشت ، هولندا) لتزويدنا في البداية ببروتوكول الزراعة العضوية. نحن نعترف بالموارد المشتركة لعلم الأنسجة والفحص المجهري لمركز CSHL للسرطان للخدمات والخبرة الفنية (NCI 2P3OCA45508). نشكر الدكتور تشينغ قاو على المساعدة في إعداد العينات النسيجية. نحن ممتنون لدعم الدكتورة كارين كوستروف (نورثويل هيلث) لتقديم عينات من أورام المرضى. كما نقدر جهود فريق البنوك الحيوية في نورثويل هيلث للحصول على العينات، ونشكر المرضى وعائلاتهم على التبرع بالأنسجة للبحث. تم دعم هذا البحث من قبل CSHL / Northwell Health (D.L.S.) ، NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) ، و Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson and D.L.S).
15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
37 °C bead bath | |||
37 °C CO2 incubator | |||
50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
Parafilm | transparent film | ||
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |