患者由来乳房オルガノイドの確立と培養
Summary
患者由来の乳房腫瘍切除術または正常な乳房組織からヒト乳房オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルがここに提供される。このプロトコルは、ヒト患者由来の乳房オルガノイドを培養、凍結、解凍するための包括的なステップバイステップの手順を提供します。
Abstract
乳がんは、いくつかの異なる組織学的および分子サブタイプに分類されている複雑な疾患です。当研究室で開発された患者由来乳房腫瘍オルガノイドは、複数の腫瘍由来細胞集団が混在しているため、確立された2Dがん細胞株よりも腫瘍細胞の多様性と環境をよりよく表しています。オルガノイドは理想的な in vitro モデルとして機能し、細胞間相互作用と癌の進行に重要な役割を果たすことが知られている細胞-細胞外マトリックス相互作用を可能にします。患者由来のオルガノイドは、ヒト由来であるため、マウスモデルよりも優れています。さらに、それらは患者の腫瘍のゲノム、トランスクリプトーム、および代謝の不均一性を再現することが示されています。したがって、それらは腫瘍の複雑さと患者の多様性を表すことができます。その結果、ターゲットの発見と検証、および薬剤感受性アッセイに関するより正確な洞察を提供する態勢を整えています。このプロトコルでは、切除された乳房腫瘍(がんオルガノイド)または縮小乳房形成術由来の乳房組織(正常オルガノイド)から患者由来の乳房オルガノイドがどのように確立されるかを詳細に説明します。これに続いて、3Dオルガノイド培養、増殖、継代、凍結、および患者由来の乳房オルガノイド培養の解凍の包括的な説明が続きます。
Introduction
乳がん(BC)は女性で最も一般的に発生する悪性腫瘍であり、2022年に米国で287,850人の新しい症例が診断されると推定されています1。毎年のスクリーニング、標的療法、および遺伝的素因のより良い理解による早期発見の最近の進歩にもかかわらず、それは米国の女性の癌による死亡の2番目に多い原因であり、年間>40,000人の乳がんで死亡しています1。乳がんは現在、原発腫瘍の組織病理学的および分子的評価に基づいて複数のサブタイプに分類されています。より良いサブタイプの層別化は、サブタイプ固有の治療オプション2で患者の転帰を改善しました。たとえば、HER2が癌原遺伝子3として同定されたことで、トラスツズマブが開発され、この非常に攻撃的なサブタイプがほとんどの患者で管理可能になりました4。この複雑な疾患の遺伝学とトランスクリプトミクスを患者固有の方法でさらに研究することは、より良い患者固有の個別化治療レジメンの開発と予測に役立ちます2,5。患者由来オルガノイド(PDO)は、分子レベルでがんに関する洞察を得て、新しい標的またはバイオマーカーを特定し、新しい治療戦略を設計するための有望な新しいモデルです6,7,8。
PDOは、新たに切除された一次組織サンプルに由来する多細胞、三次元(3D)構造である8,9。それらは、典型的には細胞外マトリックス(ECM)タンパク質の組み合わせで構成されるヒドロゲルマトリックスに埋め込まれることによって三次元的に増殖するため、腫瘍細胞とECM相互作用の研究に使用できます。PDOは患者の多様性を表し、腫瘍の細胞の不均一性および遺伝的特徴を再現する10、11、12。インビトロモデルであるため、遺伝子操作とハイスループット薬物スクリーニングが可能になります13,14,15。さらに、PDOは、臨床と並行して患者の薬物感受性および治療戦略を評価し、患者の転帰を予測するのを助けるためにもっともらしく利用することができる16、17、18。化学療法に加えて、特定のオルガノイドモデルも、化学放射線に対する個々の患者の反応を調べるために使用されています19,20。PDOの研究および臨床使用への有望な適用性を考慮して、国立がん研究所は、これらの腫瘍由来の新規がんモデルを生成および提供するために、国際コンソーシアムであるヒトがんモデルイニシアチブ(HCMI)21を開始しました。HCMIを通じて開発されたさまざまながんタイプのオルガノイドモデルの多くは、American Type Culture Collection(ATCC)22から入手できます。
正常な乳房オルガノイドは、乳腺に存在する異なる上皮細胞集団で構成されていることが示されている11,23ため、基本的な生物学的プロセスの研究、腫瘍形成を引き起こすドライバー変異の分析、および癌起源細胞系統研究のための優れたモデルとして役立ちます6,15。.乳房腫瘍オルガノイドモデルは、特に耐性腫瘍に対する新しい治療法の開発の見通しを奨励する新しい標的を特定するために使用されています24、25、26。Guillenらは、治療抵抗性乳房腫瘍の患者由来異種移植片(PDX)モデルおよびPDX由来オルガノイド(PDxO)モデルを用いて、オルガノイドが精密医療の強力なモデルであり、薬物反応の評価と直接治療の決定を並行して行うことができることを示した28。さらに、様々な免疫細胞27,28,29、線維芽細胞30,31および微生物32,33とPDOを培養するための新しい共培養法の開発は、癌の進行に対する腫瘍微小環境の影響を研究する機会を提供する。膵臓または結腸直腸腫瘍に由来するPDOについては、このような共培養法が活発に確立されているが、乳房PDOに対する同様の確立された共培養法は、ナチュラルキラー細胞34および線維芽細胞35についてのみ報告されている。
異なる乳がんサブタイプを表す>100の患者由来のオルガノイドの最初のバイオバンクは、Hans Cleversグループ36,37によって開発されました。この取り組みの一環として、Cleversグループは乳房オルガノイド増殖のための最初の複雑な培養培地も開発し、現在広く使用されています36。追跡調査では、乳房PDOおよび患者由来のオルガノイド異種移植片(PDOX)の確立と培養に関する包括的な説明が提供されました38。ウェルム研究所は、ウシ胎児血清(FBS)とより少ない成長因子を含む比較的単純な増殖培地で培養されるBC PDXモデルとPDxOの大規模なコレクションを開発しました39,40。私たちは、ナイーブな患者由来の乳がんオルガノイドモデル11を独自に開発および特性評価し、HCMIイニシアチブ21の一環としてBC PDOモデルの開発に参加しました。ここでは、患者由来の乳房オルガノイドモデルシステムを生成する際に採用されている方法論を詳述した実用的なガイドを提供することを目指しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちの研究室は、上記のプロトコルを使用して、ナイーブな腫瘍切除または掻爬からオルガノイドを確立することに成功しました。また、このプロトコルを利用して、還元性乳房形成術 で 得られた乳房組織や、がん患者の隣接または遠位の正常乳房組織から正常なオルガノイドを開発しました。切除された原発腫瘍の約30%〜40%は、長期(>継代8)腫瘍オルガノイド培養に成功しました?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業の過程で批判的な議論をしてくれたスペクターラボのメンバーに感謝します。Norman SachsとHans Clevers(オランダ、Hubrecht Institute)が最初にオルガノイド培養プロトコルを提供してくれたことに感謝します。CSHLがんセンターの組織学および顕微鏡検査の共有リソース(NCI 2P3OCA45508)のサービスおよび技術的専門知識を認めています。組織学的サンプル調製を支援してくれたQing Gao博士に感謝します。患者の腫瘍サンプルを提供してくれたカレン・コストロフ博士(ノースウェルヘルス)のサポートに感謝します。また、サンプル取得のためのノースウェルヘルスバイオバンキングチームの努力に感謝し、研究のために組織を提供してくれた患者とその家族に感謝します。この研究は、CSHL/Northwell Health (D.L.S.)、NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.)、およびLeidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson and D.L.S.)の支援を受けた。
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
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