这里提供了一个详细的方案,用于从患者来源的乳腺肿瘤切除术或正常乳腺组织中建立人乳腺类器官。该协议为培养、冷冻和解冻人类患者来源的乳腺类器官提供了全面的分步说明。
乳腺癌是一种复杂的疾病,已分为几种不同的组织学和分子亚型。我们实验室开发的患者来源乳腺肿瘤类器官由多个肿瘤来源的细胞群的混合物组成,因此比已建立的2D癌细胞系更近似于肿瘤细胞多样性和环境。类器官是一种理想的 体外 模型,允许细胞 – 细胞外基质相互作用,已知在细胞 – 细胞相互作用和癌症进展中起重要作用。患者来源的类器官也比小鼠模型具有优势,因为它们是人类来源的。此外,它们已被证明可以概括患者肿瘤的基因组、转录组和代谢异质性;因此,它们能够代表肿瘤的复杂性以及患者的多样性。因此,他们准备为靶标发现和验证以及药物敏感性测定提供更准确的见解。在该协议中,我们详细演示了如何从切除的乳腺肿瘤(癌症类器官)或还原性乳房整形术衍生的乳腺组织(正常类器官)中建立患者来源的乳腺类器官。接下来是3D类器官培养,扩增,传代,冷冻以及患者来源的乳腺类器官培养物的解冻的全面说明。
乳腺癌 (BC) 是女性中最常见的恶性肿瘤,据估计,2022 年美国将诊断出 287,850 例新病例1.尽管最近在早期发现方面取得了进展,包括年度筛查、靶向治疗和更好地了解遗传易感性,但它仍然是美国女性癌症死亡的第二大原因>,每年有 40,000 人死于乳腺癌1。乳腺癌目前根据原发肿瘤的组织病理学和分子学评估分为多种亚型。更好的亚型分层通过亚型特异性治疗方案改善了患者的预后2.例如,将HER2鉴定为原癌基因3导致了曲妥珠单抗的发展,这使得这种高度侵袭性的亚型在大多数患者中易于控制4。以患者特异性方式进一步研究这种复杂疾病的遗传学和转录组学将有助于开发和预测更好的患者特异性个性化治疗方案2,5。患者来源类器官(PDO)是一种很有前途的新模型,可以在分子水平上深入了解癌症,确定新的靶点或生物标志物并设计新的治疗策略6,7,8。
PDO是源自新鲜切除的原代组织样本的多细胞三维(3D)结构8,9。它们通过嵌入水凝胶基质(通常由细胞外基质(ECM)蛋白的组合组成)进行三维生长,因此可用于研究肿瘤细胞 – ECM相互作用。PDO代表患者的多样性,并概括了肿瘤的细胞异质性和遗传特征10,11,12。作为体外模型,它们允许基因操作和高通量药物筛选13,14,15。此外,PDO可以合理地用于评估患者的药物敏感性和与临床平行的治疗策略,并帮助预测患者结果16,17,18。除化疗外,某些类器官模型也已用于检查个体患者对放化疗的反应19,20。鉴于PDO在研究和临床应用中的可喜应用性,美国国家癌症研究所发起了一个国际联盟,即人类癌症模型倡议(HCMI)21,以生成和提供这些肿瘤衍生的新型癌症模型。通过HCMI开发的各种癌症类型的许多类器官模型可通过美国类型培养物保藏(ATCC)获得22。
正常的乳腺类器官已被证明由乳腺中存在的不同上皮细胞群组成11,23,因此可以作为研究基本生物学过程,分析导致肿瘤发生的驱动突变以及癌细胞起源谱系研究的重要模型6,15.乳腺肿瘤类器官模型已被用于识别新的靶点,这些靶点正在鼓励开发新疗法的前景,特别是对于耐药肿瘤24,25,26。Guillen等人使用患者来源的异种移植物(PDX)和匹配的PDX衍生类器官(PDxO)模型对难治性乳腺肿瘤进行研究,表明类器官是精准医学的强大模型,可用于评估药物反应和平行指导治疗决策28。此外,开发用于培养具有各种免疫细胞27,28,29,成纤维细胞30,31和微生物32,33的PDO的新共培养方法为研究肿瘤微环境对癌症进展的影响提供了机会。虽然许多此类共培养方法正在积极用于胰腺或结直肠肿瘤的PDO,但类似的乳腺PDO共培养方法仅在自然杀伤细胞34和成纤维细胞35上报道。
代表不同乳腺癌亚型的>100个患者来源类器官的第一个生物库由Hans Clevers小组36,37开发。作为这项工作的一部分,Clevers小组还开发了第一个用于乳腺类器官生长的复杂培养基,目前广泛使用36。一项后续研究全面介绍了乳腺PDO和患者来源的类器官异种移植物(PDOX)的建立和培养情况38。Welm实验室开发了大量BC PDX模型和PDxO,这些模型和PDxO在含有胎牛血清(FBS)和较少生长因子39,40的相对简单的生长培养基中培养。我们独立开发和表征了大量幼稚的患者来源的乳腺癌类器官模型11,并参与了BC PDO模型的开发,作为HCMI计划21的一部分。在这里,我们旨在提供一份实用指南,详细说明我们在生成患者衍生的乳腺类器官模型系统时采用的方法。
我们的实验室已成功采用上述方案从幼稚的肿瘤切除或刮片中建立类器官。我们还利用该协议从通过复位乳房成形术 获得 的乳腺组织或癌症患者的邻近或远端正常乳腺组织中开发正常类器官。约30%-40%的切除原发性肿瘤导致长期(>传代8)肿瘤类器官培养成功。在几次传代后逐渐变细的肿瘤类器官系要么具有正常类器官或基质细胞的生长,要么主要由非增殖性肿瘤细胞组成。进一步评估和?…
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢Spector实验室的成员在整个工作过程中进行的批判性讨论。我们感谢Norman Sachs和Hans Clevers(荷兰Hubrecht研究所)最初为我们提供他们的类器官培养方案。我们感谢CSHL癌症中心组织学和显微镜共享资源提供的服务和技术专长(NCI 2P3OCA45508)。我们感谢高青博士在组织学样本制备方面的帮助。我们感谢Karen Kostroff博士(Northwell Health)为患者提供肿瘤样本的支持。我们也感谢Northwell Health Biobank团队为样本采集所做的努力,我们感谢患者及其家人捐赠组织用于研究。这项研究得到了CSHL / Northwell Health(D.L.S.),NCI 5P01CA013106-Project 3(D.L.S.)和Leidos Biomedical HHSN26100008(David Tuveson和D.L.S.)的支持。
15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
37 °C bead bath | |||
37 °C CO2 incubator | |||
50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
Parafilm | transparent film | ||
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |