Здесь приведен подробный протокол для определения органоидов молочной железы человека из резекций опухоли молочной железы пациента или нормальной ткани молочной железы. Протокол содержит исчерпывающие пошаговые инструкции по культивированию, замораживанию и размораживанию органоидов молочной железы, полученных от пациентов.
Рак молочной железы является сложным заболеванием, которое было классифицировано на несколько различных гистологических и молекулярных подтипов. Органоиды опухолей молочной железы, полученные от пациентов, разработанные в нашей лаборатории, состоят из смеси нескольких популяций клеток, полученных из опухоли, и, таким образом, представляют собой лучшее приближение к разнообразию опухолевых клеток и среде, чем установленные 2D-линии раковых клеток. Органоиды служат идеальной моделью in vitro , позволяющей взаимодействовать между клетками и внеклеточным матриксом, которые, как известно, играют важную роль в межклеточных взаимодействиях и прогрессировании рака. Органоиды, полученные от пациентов, также имеют преимущества перед мышиными моделями, поскольку они имеют человеческое происхождение. Кроме того, было показано, что они повторяют геномную, транскриптомную, а также метаболическую гетерогенность опухолей пациентов; Таким образом, они способны представлять сложность опухоли, а также разнообразие пациентов. В результате они готовы предоставить более точную информацию об обнаружении и проверке мишеней, а также анализах чувствительности к лекарственным средствам. В этом протоколе мы предоставляем подробную демонстрацию того, как органоиды молочной железы, полученные от пациента, создаются из резецированных опухолей молочной железы (раковых органоидов) или ткани молочной железы, полученной из редуктивной маммопластики (нормальные органоиды). Затем следует всесторонний отчет о 3D-культуре органоидов, расширении, прохождении, замораживании, а также размораживании культур органоидов молочной железы, полученных от пациентов.
Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее часто встречающимся злокачественным новообразованием у женщин: по оценкам, в 2022 году в Соединенных Штатах будет диагностировано 287 850 новых случаев1. Несмотря на недавние достижения в области раннего выявления с ежегодными скринингами, таргетной терапией и лучшим пониманием генетической предрасположенности, он является второй по значимости причиной смерти от рака у женщин в Соединенных Штатах, с > 40 000 смертей ежегодно от рака молочной железы1. Рак молочной железы в настоящее время классифицируется на несколько подтипов на основе гистопатологической и молекулярной оценки первичной опухоли. Лучшая стратификация подтипов улучшила результаты лечения пациентов с вариантами лечения для конкретных подтипов2. Например, идентификация HER2 как протоонкогена3 привела к разработке трастузумаба, который сделал этот высокоагрессивный подтип управляемым у большинства пациентов4. Дальнейшие исследования генетики и транскриптомики этого сложного заболевания с учетом специфики пациента помогут в разработке и прогнозировании более эффективных персонализированных схем лечения для конкретного пациента 2,5. Органоиды, полученные от пациентов (PDO), являются многообещающей новой моделью для получения информации о раке на молекулярном уровне, выявления новых мишеней или биомаркеров и разработки новых стратегий лечения 6,7,8.
PDO представляют собой многоклеточные трехмерные (3D) структуры, полученные из недавно резецированных первичных образцов тканей 8,9. Они выращиваются трехмерно, будучи встроенными в гидрогелевую матрицу, обычно состоящую из комбинации белков внеклеточного матрикса (ECM), и, следовательно, могут использоваться для изучения взаимодействий опухолевой клетки с ECM. PDO представляют разнообразие пациентов и повторяют клеточную гетерогенность и генетические особенности опухоли10,11,12. Будучи моделями in vitro, они позволяют проводить генетические манипуляции и высокопроизводительные скрининги лекарств13,14,15. Кроме того, PDO могут быть правдоподобно использованы для оценки чувствительности пациента к лекарственным средствам и стратегий лечения параллельно с клиникой и помогают прогнозировать результаты лечения пациентов16,17,18. Помимо химиотерапии, некоторые органоидные модели также использовались для изучения индивидуальных реакций пациентов на химиолучевую терапию19,20. Учитывая многообещающую применимость PDO для исследований и клинического использования, Национальный институт рака инициировал международный консорциум The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21 для создания и предоставления этих новых моделей рака, полученных из опухолей. Многие из органоидных моделей различных типов рака, разработанных с помощью HCMI, доступны через Американскую коллекцию типовых культур (ATCC)22.
Было показано, что нормальные органоиды молочной железы состоят из различных популяций эпителиальных клеток, присутствующих в молочной железе 11,23, и, таким образом, служат отличными моделями для изучения основных биологических процессов, анализа мутаций-драйверов, вызывающих онкогенез, и для исследований происхождения раковых клеток 6,15 . Органоидные модели опухолей молочной железы были использованы для идентификации новых мишеней, которые обнадеживают перспективы для разработки новых методов лечения, особенно для резистентных опухолей24,25,26. Используя ксенотрансплантат пациента (PDX) и соответствующие модели органоидов, полученных из PDX (PDxO) резистентных к лечению опухолей молочной железы, Guillen et al. показали, что органоиды являются мощными моделями для точной медицины, которые могут быть использованы для параллельной оценки реакции на лекарства и принятия решений о прямой терапии28. Кроме того, разработка новых методов совместного культивирования ЗОП с различными иммунными клетками27,28,29, фибробластами 30,31 и микробами 32,33 дает возможность изучить влияние микроокружения опухоли на прогрессирование рака. В то время как многие такие методы совместного культивирования активно внедряются для PDO, полученных из опухолей поджелудочной железы или колоректальных опухолей, аналогичные установленные методы совместного культивирования PDO молочной железы были зарегистрированы только для естественных клеток-киллеров34 и фибробластов35.
Первый биобанк из >100 органоидов, полученных от пациентов, представляющих различные подтипы рака молочной железы, был разработан группой Ханса Клеверса36,37. В рамках этих усилий группа Clevers также разработала первую сложную питательную среду для роста органоидов молочной железы, которая в настоящее время широко используется36. Последующее исследование предоставило всесторонний отчет о создании и культивировании PDO молочной железы и органоидных ксенотрансплантатов, полученных от пациентов (PDOX)38. Лаборатория Welm разработала большую коллекцию моделей BC PDX и PDxO, которые культивируются в сравнительно более простой питательной среде, содержащей эмбриональную бычью сыворотку (FBS) и меньшее количество факторов роста39,40. Мы независимо разработали и охарактеризовали большой массив наивных моделей органоидов рака молочной железы11 и участвовали в разработке моделей BC PDO в рамках инициативыHCMI 21. Здесь мы стремимся предоставить практическое руководство с подробным описанием методологии, используемой нами при создании систем моделей органоидов молочной железы, полученных от пациентов.
Наша лаборатория успешно использовала вышеуказанные протоколы для создания органоидов из наивных опухолевых резекций или соскобов. Мы также использовали этот протокол для разработки нормальных органоидов из ткани молочной железы, полученной с помощью восстановительной маммоп?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Спектора за критические дискуссии на протяжении всей этой работы. Мы благодарим Нормана Сакса и Ханса Клеверса (Hans Clevers) из Института Хубрехта, Нидерланды за то, что они изначально предоставили нам свой протокол культивирования органоидов. Мы выражаем признательность Совместным ресурсам по гистологии и микроскопии Онкологического центра CSHL за услуги и техническую экспертизу (NCI 2P3OCA45508). Мы благодарим доктора Цин Гао за помощь в подготовке гистологического образца. Мы благодарны за поддержку доктору Карен Кострофф (Northwell Health) за предоставление пациентам образцов опухолей. Мы также высоко ценим усилия команды Northwell Health Biobanking по сбору образцов и благодарим пациентов и их семьи за пожертвование тканей для исследований. Это исследование было поддержано CSHL / Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) и Leidos Biomedical HHSN26100008 (Дэвид Тувесон и D.L.S.).
15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
37 °C bead bath | |||
37 °C CO2 incubator | |||
50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
Parafilm | transparent film | ||
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |