פרוטוקול מפורט מסופק כאן לקביעת אורגנואידי שד אנושיים מכריתות גידולי שד שמקורם במטופל או מרקמת שד רגילה. הפרוטוקול מספק הוראות מקיפות שלב אחר שלב לגידול, הקפאה והפשרה של אורגנואידי שד אנושיים שמקורם במטופלות.
סרטן השד היא מחלה מורכבת שסווגה למספר תת-סוגים היסטולוגיים ומולקולריים שונים. אורגנואידים של גידולי שד שמקורם במטופל שפותחו במעבדה שלנו מורכבים מתערובת של אוכלוסיות תאים מרובות שמקורן בגידול, ולכן מייצגים קירוב טוב יותר של מגוון תאי הגידול והסביבה מאשר קווי התאים הסרטניים הדו-ממדיים שנקבעו. אורגנואידים משמשים כמודל אידיאלי במבחנה, המאפשר אינטראקציות מטריצה תאית-חוץ-תאית, הידועות כממלאות תפקיד חשוב באינטראקציות תא-תא ובהתקדמות סרטן. לאורגנואידים שמקורם במטופל יש גם יתרונות על פני מודלים של עכברים מכיוון שהם ממקור אנושי. יתר על כן, הם הוכחו כדי לשחזר את ההטרוגניות הגנומית, transcriptomic כמו גם מטבולית של גידולים החולים; לפיכך, הם מסוגלים לייצג את מורכבות הגידול כמו גם את מגוון המטופלים. כתוצאה מכך, הם ערוכים לספק תובנות מדויקות יותר לגבי גילוי ואימות מטרות ומבחני רגישות לתרופות. בפרוטוקול זה, אנו מספקים הדגמה מפורטת של האופן שבו אורגנואידי שד שמקורם במטופל נקבעים מגידולי שד שנכרתו (אורגנואידים סרטניים) או מרקמת שד רדוקטיבית שמקורה בממופלסטיקה (אורגנואידים רגילים). זה ואחריו תיאור מקיף של תרבית אורגנואידים תלת ממדית, הרחבה, מעבר, הקפאה, כמו גם הפשרה של תרביות אורגנואידים שד שמקורם במטופל.
סרטן השד (BC) הוא הממאירות הנפוצה ביותר בקרב נשים, עם 287,850 מקרים חדשים שאובחנו בארצות הברית בשנת 20221. למרות ההתקדמות האחרונה בגילוי מוקדם עם בדיקות סקר שנתיות, טיפולים ממוקדים והבנה טובה יותר של נטייה גנטית, הוא נחשב לגורם השני המוביל למוות מסרטן בקרב נשים בארצות הברית, עם >40,000 מקרי מוות המיוחסים לסרטן השד מדי שנה1. סרטן השד מסווג כיום למספר תת-סוגים בהתבסס על הערכה היסטופתולוגית ומולקולרית של הגידול הראשוני. ריבוד טוב יותר של תת-סוג שיפר את תוצאות המטופלים עם אפשרויות טיפול ספציפיות לתת-סוג2. לדוגמה, הזיהוי של HER2 כאב-אונקוגן3 הוביל לפיתוח של Trastuzumab, אשר הפך את תת-הסוג האגרסיבי הזה לניהול ברוב החולים4. מחקר נוסף על הגנטיקה והשעתוק של מחלה מורכבת זו באופן ספציפי למטופל יסייע בפיתוח וחיזוי משטרי טיפול מותאמים אישית ספציפיים למטופלטובים יותר 2,5. אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) הם מודל חדש ומבטיח להשגת תובנות לגבי סרטן ברמה המולקולרית, זיהוי מטרות חדשות או סמנים ביולוגיים ועיצוב אסטרטגיות טיפול חדשות 6,7,8.
PDOs הם מבנים רב-תאיים, תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) שמקורם בדגימות רקמה ראשוניות 8,9 שזה עתה נותחו. הם גדלים באופן תלת ממדי על ידי היותם מוטמעים במטריצת הידרוג’ל, המורכבת בדרך כלל משילוב של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים (ECM), ולכן ניתן להשתמש בהם לחקר אינטראקציות תאי גידול-ECM. PDOs מייצגים את מגוון המטופלים ומחזירים את ההטרוגניות התאית ואת התכונות הגנטיות של הגידול10,11,12. בהיותם מודלים במבחנה, הם מאפשרים מניפולציה גנטית ומסכי תרופות בתפוקה גבוהה13,14,15. יתר על כן, PDOs יכולים לשמש באופן סביר כדי להעריך את רגישות המטופל לתרופות ואסטרטגיות טיפול במקביל למרפאה ולעזור לחזות את תוצאות המטופל16,17,18. מלבד כימותרפיה, מודלים אורגנואידים מסוימים שימשו גם כדי לבחון תגובות של חולים בודדים לכימותרפיה19,20. בהתחשב ביישומם המבטיח של PDOs למחקר ולשימוש קליני, המכון הלאומי לסרטן יזם קונסורציום בינלאומי, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, כדי ליצור ולספק מודלים חדשים אלה של סרטן שמקורם בגידולים. רבים מהמודלים האורגנואידים של סוגי סרטן שונים שפותחו באמצעות HCMI זמינים באמצעות אוסף תרביות הטיפוסים האמריקאי (ATCC)22.
אורגנואידים נורמליים של השד הוכחו כמורכבים מאוכלוסיות שונות של תאי אפיתל הנמצאים בבלוטת החלב 11,23 ולכן משמשים כמודלים נהדרים לחקר תהליכים ביולוגיים בסיסיים, לניתוח מוטציות מניעות הגורמות לגידולים, ולמחקרי שושלת תאי מוצא סרטניים 6,15 . מודלים אורגנואידים של גידולי שד שימשו לזיהוי מטרות חדשות המעודדות סיכויים לפיתוח טיפולים חדשים, במיוחד עבור גידולים עמידים24,25,26. באמצעות שימוש במודלים מותאמים של קסנוגרפט נגזר ממטופל (PDX) ואורגנואיד נגזר PDX (PDxO) תואם של גידולי שד עמידים לטיפול, Guillen et al. הראו כי אורגנואידים הם מודלים רבי עוצמה לרפואה מדויקת, אשר ניתן למנף כדי להעריך תגובות לתרופות והחלטות טיפול ישירות במקביל28. יתר על כן, פיתוח שיטות תרבית משותפת חדשות לגידול PDOs עם תאים חיסוניים שונים27,28,29, פיברובלסטים 30,31 ומיקרובים 32,33 מהווה הזדמנות לחקור את ההשפעה של מיקרו-סביבה סרטנית על התקדמות סרטן. בעוד ששיטות רבות כאלה של תרבית משותפת נקבעות באופן פעיל עבור PDOs שמקורם בגידולים בלבלב או במעי הגס, שיטות תרבית משותפת מבוססות דומות עבור PDO השד דווחו רק עבור תאי הרג טבעיים34 ופיברובלסטים35.
הבנק הביולוגי הראשון של >100 אורגנואידים שמקורם במטופלות המייצגים תת-סוגים שונים של סרטן השד פותח על ידי קבוצת Hans Clevers36,37. כחלק ממאמץ זה, קבוצת Clevers פיתחה גם את מדיום התרבית המורכב הראשון לגידול אורגנואידים של השד, הנמצא כיום בשימוש נרחב36. מחקר המשך סיפק תיאור מקיף של ההקמה והתרבות של PDO שד וקסנוגרפטים אורגנואידים שמקורם במטופלות (PDOXs)38. מעבדת Welm פיתחה אוסף גדול של מודלים של BC PDX ו-PDxOs המתורבתים במדיום גידול פשוט יחסית המכיל נסיוב בקר עוברי (FBS) ופחות גורמי גדילה39,40. פיתחנו ואפיינו באופן עצמאי מערך גדול של מודלים נאיביים של אורגנואידים לסרטן השד שמקורם במטופלות11, והשתתפנו בפיתוח מודלים של BC PDO כחלק מיוזמת HCMI21. כאן, אנו שואפים לספק מדריך מעשי המפרט את המתודולוגיה בה אנו משתמשים ביצירת מערכות מודל אורגנואידים של שד הנגזרים ממטופלות.
המעבדה שלנו השתמשה בהצלחה בפרוטוקולים הנ”ל כדי לבסס אורגנואידים מכריתות או שריטות גידולים נאיביות. השתמשנו בפרוטוקול זה גם כדי לפתח אורגנואידים נורמליים מרקמת השד המתקבלים באמצעות ממופלסטיקה רדוקטיבית או מרקמת שד רגילה סמוכה או דיסטלית של חולות סרטן. כ-30%-40% מהגידולים הראשוניים שנו?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לחברי מעבדת ספקטור על דיונים ביקורתיים לאורך עבודה זו. אנו מודים לנורמן זקס ולהנס קלברס (מכון הוברכט, הולנד) על שסיפקו לנו בתחילה את פרוטוקול תרבית האורגנואידים שלהם. אנו מכירים במרכז הסרטן CSHL היסטולוגיה ומיקרוסקופ משאבים משותפים עבור שירותים ומומחיות טכנית (NCI 2P3OCA45508). אנו מודים לד”ר צ’ינג גאו על הסיוע בהכנת דגימות היסטולוגיות. אנו אסירי תודה על תמיכתה של ד”ר קארן קוסטרוף (Northwell Health) על מתן דגימות גידול למטופלים. אנו מעריכים גם את המאמצים של צוות Northwell Health Biobanking לרכישת דגימות, ומודים לחולים ולבני משפחותיהם על תרומת רקמות למחקר. מחקר זה נתמך על ידי CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.), ו-Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson and D.L.S).
15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
37 °C bead bath | |||
37 °C CO2 incubator | |||
50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
Parafilm | transparent film | ||
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |