AAV6’ya karşı nötralize edici unsurları tespit etmek için hızlı, uygun maliyetli ve basit kolorimetrik hücre tabanlı bir test için kapsamlı bir laboratuvar protokolü ve analiz iş akışı açıklanmaktadır.
Rekombinant adeno ilişkili virüsler (rAAV), hem laboratuvarda hem de klinikte çeşitli sağlık koşullarını tedavi etmek için genetik materyal transferi için güvenli ve başarılı bir vektör olduğunu kanıtlamıştır. Bununla birlikte, AAV kapsidlerine karşı önceden var olan nötralize edici antikorlar (NAbs), hem büyük hayvan deney modellerinde hem de insan popülasyonlarında gen tedavilerinin başarılı bir şekilde verilmesi için devam eden bir zorluk oluşturmaktadır. AAV’ye karşı konak bağışıklığı için ön tarama, AAV tabanlı gen tedavilerinin hem bir araştırma aracı hem de klinik olarak uygulanabilir bir terapötik ajan olarak etkinliğini sağlamak için gereklidir. Bu protokol, AAV serotip 6’ya (AAV6) karşı nötralize edici faktörleri tespit etmek için kolorimetrik bir in vitro testini açıklar. Test, alkali fosfataz (AP) muhabir geni kodlayan bir AAV ile kombinasyon halinde çözünmeyen ölçülebilir mor bir leke oluşturan NBT/BCIP alt tabakası arasındaki reaksiyonu kullanır.
Bu protokolde serum örnekleri AP’yi ifade eden bir AAV ile birleştirilir ve potansiyel nötralizasyon aktivitesinin gerçekleşmesine izin vermek için inkübe edilir. Virüs serum karışımı daha sonra nötralize edilmemiş AAV’lerin viral transdüksiyonu için hücrelere eklenir. NBT/BCIP substratı eklenir ve viral transdüksiyon ve nötralize edici aktiviteye karşılık gelen kromojenik bir reaksiyona uğrar. Renkli alan oranı, nötralize edici titreler oluşturmak için özgür bir yazılım aracı kullanılarak nicelleştirilir. Bu test, renklenme ve viral konsantrasyon arasında güçlü bir pozitif korelasyon görüntüler. Rekombinant AAV6’nın uygulamadan önce ve sonra koyunlardan alınan serum örneklerinin değerlendirilmesi nötralize edici aktivitede çarpıcı bir artışa yol açtı (125 ila >10.000 kat artış). Test, 1:32.000 > serum seyreltmesinde nötralizasyon aktivitesini tespit etmek için yeterli hassasiyet gösterdi. Bu tahlil, NAB’leri AAV’lere karşı tespit etmek için basit, hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar.
Adeno ilişkili virüsler (AAV), gen tedavilerinin kardiyovasküler, pulmoner, dolaşım, oküler ve merkezi sinir sistemlerini etkileyen çeşitli sağlık durumları için deneme tedavilerine ulaştırılmasında vektör olarak giderek daha fazla kullanılmaktadır1,2,3,4,5. AAV vektörlerinin önde gelen gen tedavisi platformu olarak popülaritesi, pozitif güvenlik profili, uzun süreli transgene ekspresyasyonu ve dokuya özgü geniş kapsamlı tropizmlerinden kaynaklanmaktadır1,6. Hayvan çalışmalarındaki başarılı sonuçlar, etkinlik uç noktalarına başarıyla ulaşan elliden fazla AAV gen tedavisi klinik denemesinin ve ABD Gıda ve İlaç İdaresi8 tarafından onaylanan ilk ticari olarak mevcut AAV gen tedavisi ilacının piyasaya sürülmesinin önünü açmıştır8. İlk başarıların ardından, AAV tercih edilen bir vektör olarak temel ve klinik araştırma sektörlerinde ilgi görmeye devam etti ve şu anda ABD ve Avrupa’da klinik kullanım için onaylanan tek in vivo gen tedavisi9. Bununla birlikte, AAV vektör kapsidlerine karşı önceden var olan nötralize edici antikorların (NAbs) varlığı hem klinik öncesi araştırmalara hem de klinik çalışmaların etkinliğine engel olmaya devam etmektedir. NAb’ler hem naif insan hem de hayvan popülasyonlarında bulunur ve bir AAV vektörün in vivo yönetimini takiben gen transdüksiyonu inhibe eder1. AAV seropozitliği çoğu gen tedavisi denemesi için bir dışlama kriteridir ve bu nedenle konak bağışıklığı için ön tarama hem laboratuvarda hem de klinikte çok önemlidir. AAV’ye karşı NAB’lerin varlığını tespit edebilecek bir test oluşturmak, herhangi bir AAV gen terapisi tabanlı araştırma projesinin boru hattında önemli bir adımdır. Bu rapor, çizgili kas (kalp ve iskelet kası)1,10,11,12’de etkili ve seçici transdüksiyon nedeniyle araştırmacıların ilgisini çeken AAV6’ya odaklanmıştır. Gen tedavisi kalbi hedeflemek için umut verici bir strateji olarak kabul edilir, çünkü invaziv açık kalp prosedürleri olmadan kalbi özellikle hedeflemek zordur.
Nötralize edici aktivite genellikle hücre bazlı in vitro veya in vivo transdüksiyon inhibisyon tahlili kullanılarak belirlenir. In vivo NAb tahlilleri genellikle serumun bir denekten (örneğin, insan veya büyük hayvan) farelere verilmesini, ardından muhabir geni olan bir AAV’nin ve ardından muhabir geninin veya ilgili antijenin ekspresyozunun testini içerir. İn vitro tahliller, bir muhabir genini ifade eden rekombinant AAV (rAAV) ile seri seyreltmelerde insan veya büyük bir hayvandan serum veya plazma inkübasyon yaparak NAb titrlerini belirler. Hücreler serum/virüs karışımı ile enfekte edilir ve muhabir gen ekspresyonlarının ne ölçüde inhibe edildiği kontrollerle karşılaştırıldığında değerlendirilir. In vitro tahliller, in vivo testlere kıyasla nispeten daha düşük maliyeti, testlerdeki hızlılığı ve standardizasyon ve doğrulama için daha fazla kapasite13,14 nedeniyle NAb taraması için yaygın olarak kullanılmaktadır. In vivo tahlillerin genellikle daha fazla hassasiyete sahip olduğu bildirilmektedir15,16, ancak aynı iddia in vitro tahlillerle ilgili olarak da ortaya atıldı14,17.
Bugüne kadar, in vitro NAb tahlilleri nötralizasyonunu tespit etmek için muhabir geni olarak esas olarak lüminesans (luciferaz) kullanmıştır. Işık tabanlı bir yöntemin birçok bağlamda değeri olsa da, kolorimetrik/kromojenik bir NAb tahlili bazı durumlarda avantajlı olabilir. Nötralizasyonunu değerlendirmek için yapılan kolorimetrik tahliller influenza ve adenovirüs gibi diğer virüsler için başarıyla sunulmuştir18,19. Çekicilikleri basitliklerinden, daha düşük maliyetlerinden ve sadece günlük laboratuvar cihazları ve araçları için gereksinimden kaynaklanmaktadır20. Lüminesans tabanlı bir muhabir geni kullanan NAb tahlilleri, yüksek maliyetli substrat kitleri, bir luminometre ve analiz için ilgili yazılım gerektirir21. Bu kolorimetrik test, sadece hafif bir mikroskop ve çok ucuz bir substrat gerektirme avantajına sahiptir. Kolorimetrik ve parlak testlere karşı duyarlılığının raporlanması çelişkili sonuçlar verdi. Bir çalışma, lüminesans tabanlı ELISA testlerinin daha fazla hassasiyet ve kolorimetrik testlerle karşılaştırılabilir tekrarlanabilirlik gösterdiği öne sürsürürd22, bir diğeri ise daha fazla hassasiyet sağlamak için kolorimetrik tabanlı ELISA tahlilleri buldu23. Burada, alkali fosfataz (AP) muhabir geni ile nitro mavisi tetrazolium /5-bromo-4-kloro-3-indolyl fosfat (NBT/BCIP) substratı arasındaki kromojenik reaksiyonu kullanan AAV’ye karşı bir in vitro NAb tahlili için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu adım adım protokol, AAV24’e karşı nötralize edici aktiviteyi tespit etmek için hPLAP (insan plasntal alkali fosfataz) muhabir geni (AAV6-hPLAP) kullanan önceki bir rapora dayanarak geliştirilmiştir. Bu test uygun maliyetli, zaman verimli, kurulumu kolaydır ve minimum teknik beceri, laboratuvar ekipmanı ve reaktif gerektirir. Ayrıca, bu tahlilin basitliği, farklı hücre, doku veya viral serotip türlerinde geniş uygulamalar için optimize edilebilir potansiyel verir.
Bu rapor, in vitro viral transdüksiyon derecesine karşılık gelen kromojenik reaksiyonu değerlendirerek belirli bir serum örneğinde AAV nötralizasyonunun kapsamını değerlendiren kolorimetrik bir tahlil açıklanmaktadır. Protokolün geliştirilmesi, immünhistokimi gibi uygulamalarda protein hedeflerinin tespiti için bir boyama aracı ve viral transdüksiyonu değerlendirmek için bir muhabir aracı olarak yaygın olarak kullanılan alkali fosfataz enzimi ile NBT/BCIP arasındaki bilinen kromojenik r…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, JRM ve CJT’ye Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Proje Hibesi (ID 1163732) ve kısmen Victoria Hükümeti’nin Operasyonel Altyapı Destek Programı tarafından finanse edildi. SB, Baker Kalp ve Diyabet Enstitüsü-La Trobe Üniversitesi Doktora Bursu ile desteklenmektedir. KLW, Avustralya Ulusal Kalp Vakfı’ndan (ID 102539) Shine On Foundation ve Geleceğin Lider Bursu tarafından desteklenmektedir. JRM, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Kıdemli Araştırma Bursu (ID 1078985) tarafından desteklenmektedir.
0.05% Trypsin/EDTA | Gibco | 25300-054 | |
50 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-432-22 | Or equivalent |
75 cm2 square flasks | Falcon | 353136 | Or equivalent |
96 well flat bottomed plate | Falcon | 353072 | |
AAV6-CMV-hPLAP Vector | Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request. | ||
Aluminium foil | |||
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) | PROGEN | 610159 | Positive control monoclonal antibody |
BCIP/NBT | SIGMAFAST | B5655 | |
Cell and tissue culture safety cabinet | |||
Electronic Pipette | 5 & 10 mL stripette inserts | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
Haemocytometer | |||
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965118 | |
HT1080 cells | ATCC | ||
ImageJ Software | Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
Light microscope with camera | Capable of taking photos with a 4x objective lens | ||
Oven | For a 65 °C incubation | ||
Paraformaldehyde | MERCK | 30525-89-4 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline | |||
Pipettes and tips | 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette | ||
Stericup quick release filter | Millipore | S2GPU10RE | Used for combining media reagents |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator | Greiner BIO-ONE | 455071 | Used for serum collection & processing from sheep |
Water bath |