색색세포 기반 분석법을 사용하여 AAV에 대한 항체 중화를 검출하는 단계별 방법
Summary
포괄적인 실험실 프로토콜 및 분석 워크플로우는 AAV6에 대한 중화 요소를 감지하기 위해 신속하고 비용 효율적이며 간단한 색채 세포 기반 분석법을 위해 설명됩니다.
Abstract
재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)는 실험실과 클리닉 모두에서 다양한 건강 상태를 치료하기 위해 유전 물질을 옮기는 안전하고 성공적인 벡터로 입증되었습니다. 그러나, AAV capsids에 대하여 기존의 중화 항체 (NAbs)는 큰 동물 실험 모형 및 인간 인구 둘 다에 있는 유전자 치료의 성공적인 행정을 위한 지속적인 도전을 제기합니다. AAV에 대한 숙주 면역을 위한 예비 스크리닝은 연구 도구와 임상적으로 실행 가능한 치료제로서 AAV 기반 유전자 치료의 효능을 보장하기 위해 필요하다. 이 프로토콜은 AAV 혈청형 6(AAV6)에 대한 중화 요인을 감지하기 위해 체외 분석에서 착색을 설명합니다. 분석은 알칼리성 인산화(AP) 리포터 유전자와 그 기판 NBT/BCIP 사이의 반응을 활용하여 조합시 불용성 정량화 가능한 보라색 얼룩을 생성한다.
이 프로토콜에서 혈청 샘플은 AP를 표현하는 AAV와 결합되어 잠재적 중화 활동이 발생할 수 있도록 배양됩니다. 바이러스 혈청 혼합물은 이후에 중화되지 않은 모든 AAV의 바이러스 성 변환을 허용하기 위해 세포에 첨가됩니다. NBT/BCIP 기판이 첨가되고 바이러스 성 트랜스듀션 및 중화 활동에 대응하는 염색체 반응을 겪는다. 영역 색상의 비율은 자유 소프트웨어 도구를 사용하여 양으로 양화되어 중화 티터를 생성합니다. 이 분석은 착색과 바이러스 성 농도 사이의 강한 긍정적 인 상관 관계를 표시합니다. 재조합 AAV6의 투여 전후 양으로부터의 혈청 샘플의 평가는 중화 활성의 극적인 증가로 이어졌다 (125 받는 >10,000 배 증가). 분석은 >1:32,000 혈청 희석제에서 중화 활동을 감지하는 적절한 감도를 나타냈다. 이 분석법은 AAV에 대한 NAbs를 감지하는 간단하고 빠르며 비용 효율적인 방법을 제공합니다.
Introduction
아데노 관련 바이러스(AAV)는 심혈관, 폐, 순환, 안구 및 중추 신경계에 영향을 미치는 다양한 건강 상태에 대한 임상 시험 치료에 유전자 요법을 전달하기 위한 벡터로 점점 더 많이 사용되고 있다1,2,3,4,5. 선도적인 유전자 치료 플랫폼으로서 AAV 벡터의 인기는 양성 안전 성, 장기 간 질유전자 발현 및 광범위한 조직 별 트로피즘1,6에서 비롯됩니다. 동물 연구에서 성공적인 결과는 성공적으로 그들의 효험 끝점에 도달한 50 개 이상의 AAV 유전자 치료 임상 시험을 위한 도로를 포장했습니다7, 미국 식품 의약국에 의해 승인된 첫번째 상업적으로 유효한 AAV 유전자 치료 약의 방출8. 초기 성공에 이어, AAV는 선택의 벡터로서 기본 및 임상 연구 분야에서 견인력을 계속 얻고 있으며 현재 미국과 유럽에서 임상 사용을 위해 승인 된 유일한 생체 유전자 치료법입니다9. 그럼에도 불구하고, AAV 벡터 캡시드에 대한 기존의 중화 항체(NAbs)의 존재는 임상 전 연구와 임상 시험의 효능 모두에 방해가 되고 있다. NAbs는 순진한 인간과 동물 집단 모두에서 존재하며 AAV 벡터1의 생체 투여에 따른 유전자 전이를 억제한다. AAV 혈청화는 대부분의 유전자 치료 예심을 위한 제외 기준이고, 그러므로 호스트 면제를 위한 예비 검열은 실험실과 진료소 둘 다에서 중요합니다. AAV에 대한 NAbs의 존재를 감지할 수 있는 분석서를 확립하는 것은 모든 AAV 유전자 치료 기반 연구 프로젝트의 파이프라인에 필수적인 단계입니다. 이 보고서는 AAV6에 초점을 맞추고 있다 그 효율적이 고 선택적 변환 으로 인해 연구자에 게 관심 있다 (심장과 골격 근육)1,10,11,12. 유전자 치료는 침략적인 개방 심장 절차 없이 심혼을 구체적으로 표적으로 하기 어렵기 때문에 심혼을 표적으로 하기 위한 유망한 전략으로 여겨됩니다.
중화 활성은 일반적으로 세포 기반 의 체외 또는 생체 내 트랜스포션 억제 분석체를 사용하여 결정된다. 생체 내 NAb assays는 일반적으로 시험 대상자(예를 들어, 인간 또는 큰 동물)로부터 혈청을 마우스로 투여하고, 리포터 유전자를 가진 AAV가 그 뒤를 잇고, 이어서 리포터 유전자 또는 해당 항원의 발현을 위한 테스트를 포함한다. 시험관 내 실험은 리포터 유전자를 표현하는 재조합 AAV(rAAV)를 사용하여 인간 또는 대형 동물로부터 혈청 또는 플라즈마를 배양하여 NAb 티터를 결정합니다. 세포는 혈청/바이러스 혼합물에 감염되고, 리포터 유전자 발현이 억제되는 정도는 대조군과 비교하여 평가된다. 시험관 내 소는 상대적으로 낮은 비용, 테스트의 급속성 및 생체 내 에세이에 비해 표준화 및 유효성 검사에 대한 더 큰 용량으로 인해 NAb 스크리닝에 널리 사용됩니다. 생체 내 아세약은 종종 더 큰 감도가보고15,16, 하지만 같은 주장은 체외 애사14,17에 관한 만들어졌다.
현재까지, 시험관 내 NAb 아세약은 주로 발광(luciferase)을 중화를 검출하기 위해 기자 유전자로서 사용하였다. 빛 기반 방법은 많은 맥락에서 장점이 있지만, 색색/염색체 NAb 분석법은 어떤 상황에서도 유리할 수 있다. 중화를 평가하기 위한 색인 분석법에서는 인플루엔자 및 아데노바이러스18,19와 같은 다른 바이러스에 성공적으로 사용되었습니다. 그들의 매력은 단순함, 저렴한 비용 및 일상적인 실험실 장치 및 tools20에 대한 요구 사항에서 비롯됩니다. 발광 기반 리포터 유전자를 사용하는 NAb 분석은 분석21에 비용이 많이 드는 기판 키트, 광미계 및 해당 소프트웨어가 필요합니다. 이 색분석 분석은 가벼운 현미경과 매우 저렴한 기판을 필요로하는 장점이 있습니다. 색인과 발광 분석의 민감도에 대한 보고는 상충하는 결과를 낳았습니다. 한 연구는 발광 기반 ELISA 분석 이 더 큰 감도 및 색상 분석에 비교 재현성을 표시 제안 22, 다른 발견 된 색인식 기반 ELISA 분석 더 큰 감도23. 여기서, 알칼리인스파타제(AP) 리포터 유전자와 니트로 블루 테트라졸륨/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 인산염(NBT/BCIP) 기산염(NBT/BCIP) 기산염을 인코딩하는 AAV 사이의 염색체 반응을 활용하는 AAV에 대한 시험관 NAb 분석에 대한 상세한 프로토콜이 제공된다. 이러한 단계별 프로토콜은 AAV24에 대한 중화 활성을 검출하기 위해 hPLAP(인간 태반 알칼리인스파라스) 리포터 유전자(AAV6-hPLAP)를 활용한 이전 보고서에 기초하여 개발되었다. 이 분석법은 비용 효율적이고 시간 효율적이며 설치가 용이하며 최소한의 기술 기술, 실험실 장비 및 시약이 필요합니다. 더욱이, 이 분석의 단순성은 세포, 조직, 또는 바이러스성 혈청형의 다른 모형에 걸쳐 광범위한 응용에 최적화될 가능성을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 보고서는 체외 바이러스 성 트랜스듀션의 정도에 해당하는 염색체 반응을 평가하여 주어진 혈청 샘플에서 AAV 중화의 정도를 평가하는 색법 분석법을 설명합니다. 프로토콜의 개발은 면역 조직화학과 같은 응용 분야에서 단백질 표적의 검출을 위한 스테닝 도구로 널리 활용되고 있는 효소 알칼리인인포스파아제와 NBT/BCIP 사이의 공지된 염색체 반응에 기초하여, 바이러스 성 전도를 평가…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 JRM과 CJT (ID 1163732)에 대한 국가 보건 및 의료 연구 위원회 프로젝트 보조금에 의해 부분적으로 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램에 의해 지원되었습니다. SB는 공동 베이커 심장과 당뇨병 연구소 – 라 트로브 대학 박사 장학금에 의해 지원됩니다. KLW는 샤인 온 재단과 호주 국립 심장 재단 (ID 102539)의 미래 지도자 펠로우십에 의해 지원됩니다. JRM은 국민 건강 및 의학 연구 위원회 수석 연구 펠로우십 (ID 1078985)에 의해 지원됩니다.
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-432-22 | Or equivalent |
| 75 cm2 square flasks | Falcon | 353136 | Or equivalent |
| 96 well flat bottomed plate | Falcon | 353072 | |
| AAV6-CMV-hPLAP Vector | Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request. | ||
| Aluminium foil | |||
| Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) | PROGEN | 610159 | Positive control monoclonal antibody |
| BCIP/NBT | SIGMAFAST | B5655 | |
| Cell and tissue culture safety cabinet | |||
| Electronic Pipette | 5 & 10 mL stripette inserts | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
| Haemocytometer | |||
| High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965118 | |
| HT1080 cells | ATCC | ||
| ImageJ Software | Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| Light microscope with camera | Capable of taking photos with a 4x objective lens | ||
| Oven | For a 65 °C incubation | ||
| Paraformaldehyde | MERCK | 30525-89-4 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline | |||
| Pipettes and tips | 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette | ||
| Stericup quick release filter | Millipore | S2GPU10RE | Used for combining media reagents |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator | Greiner BIO-ONE | 455071 | Used for serum collection & processing from sheep |
| Water bath |
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