Описан комплексный лабораторный протокол и рабочий процесс анализа для быстрого, экономически эффективного и простого колориметрического анализа на основе клеток для обнаружения нейтрализующих элементов против AAV6.
Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV) оказались безопасным и успешным вектором для передачи генетического материала для лечения различных состояний здоровья как в лаборатории, так и в клинике. Тем не менее, ранее существовавшие нейтрализующие антитела (NAbs) против капсидов AAV представляют собой постоянную проблему для успешного введения генной терапии как в экспериментальных моделях крупных животных, так и в человеческих популяциях. Предварительный скрининг на иммунитет хозяина против AAV необходим для обеспечения эффективности генной терапии на основе AAV как исследовательского инструмента, так и в качестве клинически жизнеспособного терапевтического агента. Этот протокол описывает колориметрический анализ in vitro для обнаружения нейтрализующих факторов против серотипа AAV 6 (AAV6). Анализ использует реакцию между AAV, кодирующим ген-репортер щелочной фосфатазы (AP), и его субстратом NBT / BCIP, который генерирует нерастворимое количественно оцениваемое фиолетовое пятно при комбинации.
В этом протоколе образцы сыворотки объединяются с AAV-экспрессирующим AP и инкубируются, чтобы обеспечить потенциальную нейтрализующую активность. Смесь вирусной сыворотки впоследствии добавляется к клеткам, чтобы обеспечить вирусную трансдукцию любых AAV, которые не были нейтрализованы. Субстрат NBT/BCIP добавляется и подвергается хромогенной реакции, соответствующей вирусной трансдукции и нейтрализующей активности. Доля окрашенной площади количественно измеряется с помощью инструмента свободного программного обеспечения для генерации нейтрализующих титров. Этот анализ показывает сильную положительную корреляцию между окраской и концентрацией вируса. Оценка образцов сыворотки крови овец до и после введения рекомбинантного AAV6 привела к резкому увеличению нейтрализующей активности (увеличение в 125->10 000 раз). Анализ показал адекватную чувствительность для выявления нейтрализующей активности в >1:32 000 сывороточных разведений. Этот анализ обеспечивает простой, быстрый и экономически эффективный метод обнаружения NAb против AAV.
Аденоассоциированные вирусы (AAV) все чаще используются в качестве векторов для доставки генной терапии для пробного лечения различных состояний здоровья, которые влияют на сердечно-сосудистую, легочную, кровеносную, глазную и центральную нервную системы1,2,3,4,5. Популярность векторов AAV в качестве ведущей платформы генной терапии обусловлена их положительным профилем безопасности, долгосрочной экспрессией трансгенов и широким спектром тканеспецифических тропизмов1,6. Успешные результаты в исследованиях на животных проложили путь для более чем пятидесяти клинических испытаний генной терапии AAV, которые успешно достигли своих конечных точек эффективности7, а также выпуск первого коммерчески доступного препарата генной терапии AAV, одобренного Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США8. После первоначальных успехов AAV продолжает набирать обороты в секторах фундаментальных и клинических исследований в качестве вектора выбора и в настоящее время является единственной генной терапией in vivo, одобренной для клинического использования в США и Европе9. Тем не менее, наличие ранее существовавших нейтрализующих антител (NAbs) против капсидов вектора AAV остается препятствием как для доклинических исследований, так и для эффективности клинических испытаний. NAb присутствуют как в наивных популяциях людей, так и в популяциях животных и ингибируют трансдукцию генов после введения in vivo вектора AAV1. Серопозитивность AAV является критерием исключения для большинства испытаний генной терапии, и поэтому предварительный скрининг на иммунитет хозяина имеет решающее значение как в лаборатории, так и в клинике. Создание анализа, который может обнаружить присутствие NAb против AAV, является важным шагом в рамках любого исследовательского проекта на основе генной терапии AAV. В этом отчете основное внимание уделяется AAV6, который представляет интерес для исследователей из-за его эффективной и селективной трансдукции в поперечно-полосатых мышцах (сердце и скелетные мышцы) 1,10,11,12. Генная терапия считается многообещающей стратегией для нацеливания на сердце, потому что трудно конкретно нацелиться на сердце без инвазивных процедур на открытом сердце.
Нейтрализующую активность обычно определяют с помощью клеточного анализа ингибирования трансдукции in vitro или in vivo. In vivo Анализы NAb обычно включают введение сыворотки от испытуемого (например, человека или крупного животного) мышам, за которым следует AAV с репортерным геном, с последующим тестированием экспрессии репортерного гена или соответствующего антигена. Анализы in vitro определяют титры NAb путем инкубации сыворотки или плазмы человека или крупного животного в серийных разведениях рекомбинантным AAV (rAAV), который экспрессирует репортерный ген. Клетки инфицируются смесью сыворотки и вируса, и степень, в которой экспрессия репортерного гена ингибируется, оценивается по сравнению с контрольной группой. Анализы in vitro широко используются для скрининга NAb из-за их сравнительно более низкой стоимости, быстроты тестирования и большей способности к стандартизации и валидации13,14 по сравнению с анализами in vivo. Часто сообщается, что анализы in vivo обладают большей чувствительностью15,16, но то же самое утверждение было сделано в отношении анализов in vitro14,17.
На сегодняшний день анализы in vitro NAb в основном используют люминесценцию (люциферазу) в качестве гена-репортера для обнаружения нейтрализации. Хотя метод, основанный на свете, имеет свои достоинства во многих контекстах, колориметрический/хромогенный анализ NAb может быть полезным в некоторых обстоятельствах. Колориметрические анализы для оценки нейтрализации были успешно использованы для других вирусов, таких как грипп и аденовирус18,19. Их привлекательность проистекает из их простоты, более низкой стоимости и потребности только в повседневной лабораторной аппаратуре и инструментах20. Анализы NAb, в которых используется репортерный ген на основе люминесценции, требуют дорогостоящих наборов субстратов, люминометра и соответствующего программного обеспечения для анализа21. Этот колориметрический анализ имеет то преимущество, что требует только светового микроскопа и очень дешевой подложки. Отчетность о чувствительности колориметрических и люминесцентных анализов дала противоречивые результаты. Одно исследование показало, что анализы ИФА на основе люминесценции демонстрируют большую чувствительность и сопоставимую воспроизводимость с колориметрическими анализами22, в то время как другое обнаружило, что анализы ИФА на основе колориметрии придают большую чувствительность23. Здесь представлен подробный протокол для анализа in vitro NAb против AAV, который использует хромогенную реакцию между AAV, кодирующим ген-репортер щелочной фосфатазы (AP), и нитро-синим тетразолием / 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфатным (NBT / BCIP) субстратом. Этот пошаговый протокол был разработан на основе предыдущего отчета, в котором использовался ген-репортер hPLAP (человеческая плацентарная щелочная фосфатаза) (AAV6-hPLAP) для обнаружения нейтрализующей активности против AAV24. Этот анализ является экономически эффективным, эффективным по времени, простым в настройке и требует минимальных технических навыков, лабораторного оборудования и реагентов. Кроме того, простота этого анализа дает ему возможность быть оптимизированным для широкого применения в различных типах клеток, тканей или вирусных серотипов.
В этом отчете описывается колориметрический анализ, который оценивает степень нейтрализации AAV в данном образце сыворотки путем оценки хромогенной реакции, соответствующей степени вирусной трансдукции in vitro. Разработка протокола была основана на известной хромогенной реакции м?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование финансировалось грантом Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям JRM и CJT (ID 1163732) и частично Программой поддержки оперативной инфраструктуры правительства Виктории. SB поддерживается совместной докторской стипендией Института сердца и диабета Бейкера и Университета Ла Троуб. KLW поддерживается Фондом «Сияние» и стипендией «Будущий лидер» от Национального фонда сердца Австралии (ID 102539). JRM поддерживается Старшим научным сотрудником Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (ID 1078985).
0.05% Trypsin/EDTA | Gibco | 25300-054 | |
50 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-432-22 | Or equivalent |
75 cm2 square flasks | Falcon | 353136 | Or equivalent |
96 well flat bottomed plate | Falcon | 353072 | |
AAV6-CMV-hPLAP Vector | Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request. | ||
Aluminium foil | |||
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) | PROGEN | 610159 | Positive control monoclonal antibody |
BCIP/NBT | SIGMAFAST | B5655 | |
Cell and tissue culture safety cabinet | |||
Electronic Pipette | 5 & 10 mL stripette inserts | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
Haemocytometer | |||
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965118 | |
HT1080 cells | ATCC | ||
ImageJ Software | Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
Light microscope with camera | Capable of taking photos with a 4x objective lens | ||
Oven | For a 65 °C incubation | ||
Paraformaldehyde | MERCK | 30525-89-4 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline | |||
Pipettes and tips | 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette | ||
Stericup quick release filter | Millipore | S2GPU10RE | Used for combining media reagents |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator | Greiner BIO-ONE | 455071 | Used for serum collection & processing from sheep |
Water bath |