Ein umfassendes Laborprotokoll und ein Analyse-Workflow werden für einen schnellen, kostengünstigen und unkomplizierten kolorimetrischen zellbasierten Assay zur Erkennung neutralisierender Elemente gegen AAV6 beschrieben.
Rekombinante Adeno-assoziierte Viren (rAAV) haben sich als sicherer und erfolgreicher Vektor für die Übertragung von genetischem Material zur Behandlung verschiedener Gesundheitszustände sowohl im Labor als auch in der Klinik erwiesen. Bereits vorhandene neutralisierende Antikörper (NAbs) gegen AAV-Kapside stellen jedoch eine ständige Herausforderung für die erfolgreiche Verabreichung von Gentherapien sowohl in experimentellen Großtiermodellen als auch in menschlichen Populationen dar. Ein vorläufiges Screening auf Wirtsimmunität gegen AAV ist notwendig, um die Wirksamkeit von AAV-basierten Gentherapien sowohl als Forschungsinstrument als auch als klinisch tragfähiges Therapeutikum sicherzustellen. Dieses Protokoll beschreibt einen kolorimetrischen In-vitro-Assay zum Nachweis neutralisierender Faktoren gegen AAV-Serotyp 6 (AAV6). Der Assay nutzt die Reaktion zwischen einem AAV, das für ein alkalisches Phosphatase (AP)-Reportergen kodiert, und seinem Substrat NBT/BCIP, das bei kombination eine unlösliche quantifizierbare violette Färbung erzeugt.
In diesem Protokoll werden Serumproben mit einem AAV-exprimierenden AP kombiniert und inkubiert, um eine mögliche neutralisierende Aktivität zu ermöglichen. Die Virusserummischung wird anschließend den Zellen zugesetzt, um die virale Transduktion von AAVs zu ermöglichen, die nicht neutralisiert wurden. Das NBT/BCIP-Substrat wird zugegeben und durchläuft eine chromogene Reaktion, die der viralen Transduktion und neutralisierenden Aktivität entspricht. Der Anteil der farbigen Fläche wird mit einem kostenlosen Software-Tool quantifiziert, um neutralisierende Titer zu generieren. Dieser Assay zeigt eine starke positive Korrelation zwischen Färbung und Viruskonzentration. Die Beurteilung von Serumproben von Schafen vor und nach verabreichung eines rekombinanten AAV6 führte zu einem dramatischen Anstieg der neutralisierenden Aktivität (125 bis >10.000-fache Zunahme). Der Assay zeigte eine ausreichende Sensitivität, um neutralisierende Aktivität in >1:32.000 Serumverdünnungen nachzuweisen. Dieser Assay bietet eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zum Nachweis von NAbs gegen AAVs.
Adeno-assoziierte Viren (AAV) werden zunehmend als Vektoren für die Verabreichung von Gentherapien zur Erprobung von Behandlungen für verschiedene Gesundheitszustände verwendet, die sich auf das Herz-Kreislauf-, Kreislauf-, Augen- und Zentralnervensystem auswirken1,2,3,4,5. Die Beliebtheit von AAV-Vektoren als führende Gentherapieplattform beruht auf ihrem positiven Sicherheitsprofil, ihrer langfristigen Transgenexpression und ihren weitreichenden gewebespezifischen Tropismen1,6. Erfolgreiche Ergebnisse in Tierversuchen haben den Weg für über fünfzig klinische AAV-Gentherapie-Studien geebnet, die ihre Wirksamkeitsendpunkte erfolgreich erreicht haben7, sowie für die Freigabe des ersten kommerziell erhältlichen AAV-Gentherapeutikums, das von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zugelassen wurde8. Nach ersten Erfolgen hat AAV in der Grundlagen- und klinischen Forschung als bevorzugter Vektor weiter an Zugkraft gewonnen und ist derzeit die einzige in vivo Gentherapie, die in den USA und Europa für den klinischen Einsatz zugelassen ist9. Nichtsdestotrotz bleibt das Vorhandensein bereits vorhandener neutralisierender Antikörper (NAbs) gegen AAV-Vektorkaside ein Hindernis sowohl für die präklinische Forschung als auch für die Wirksamkeit klinischer Studien. NAbs sind sowohl in naiven menschlichen als auch in tierischen Populationen vorhanden und hemmen die Gentransduktion nach in vivo Verabreichung eines AAV-Vektors1. Die AAV-Seropositivität ist ein Ausschlusskriterium für die meisten gentherapeutischen Studien, und daher ist das vorläufige Screening auf Wirtsimmunität sowohl im Labor als auch in der Klinik von entscheidender Bedeutung. Die Etablierung eines Assays, der das Vorhandensein von NAbs gegen AAV nachweisen kann, ist ein wesentlicher Schritt in der Pipeline eines AAV-Gentherapie-basierten Forschungsprojekts. Dieser Bericht konzentriert sich auf AAV6, das für Forscher aufgrund seiner effizienten und selektiven Transduktion in quergestreiften Muskeln (Herz und Skelettmuskel) von Interesse war 1,10,11,12. Die Gentherapie gilt als vielversprechende Strategie für das Targeting des Herzens, da es schwierig ist, das Herz ohne invasive Verfahren am offenen Herzen gezielt anzusprechen.
Die neutralisierende Aktivität wird normalerweise entweder mit einem zellbasierten In-vitro- oder einem In-vivo-Transduktionshemmungsassay bestimmt. Im lebenden Organismus NAb-Assays beinhalten in der Regel die Verabreichung von Serum von einer Testperson (z. B. Mensch oder Großtier) an Mäuse, gefolgt von einem AAV mit einem Reportergen, gefolgt von einem Test auf die Expression des Reportergens oder des entsprechenden Antigens. In-vitro-Assays bestimmen NAb-Titer durch Inkubation von Serum oder Plasma von einem Menschen oder Großtier in seriellen Verdünnungen mit einem rekombinanten AAV (rAAV), das ein Reportergen exprimiert. Zellen werden mit dem Serum/Virus-Gemisch infiziert, und das Ausmaß, in dem die Reportergenexpression gehemmt wird, wird im Vergleich zu Kontrollen bewertet. In-vitro-Assays werden aufgrund ihrer vergleichsweise niedrigeren Kosten, ihrer Schnelligkeit bei Tests und ihrer größeren Kapazität für die Standardisierung und Validierung häufig für das NAb-Screening verwendet13,14 im Vergleich zu In-vivo-Assays. Es wird häufig berichtet, dass In-vivo-Assays eine höhere Sensitivität aufweisen15,16, aber die gleiche Behauptung wurde in Bezug auf In-vitro-Assays gemacht14,17.
Bisher haben In-vitro-NAb-Assays hauptsächlich Lumineszenz (Luciferase) als Reportergen verwendet, um die Neutralisation nachzuweisen. Obwohl eine lichtbasierte Methode in vielen Kontexten Von Vorteil ist, kann ein kolorimetrischer/chromogener NAb-Assay unter bestimmten Umständen vorteilhaft sein. Kolorimetrische Assays zur Beurteilung der Neutralisation wurden erfolgreich für andere Viren wie Influenza und Adenovirus eingesetzt18,19. Ihre Attraktivität ergibt sich aus ihrer Einfachheit, ihren niedrigeren Kosten und der Anforderung an alltägliche Laborgeräte und –werkzeuge20. NAb-Assays, die ein Lumineszenz-basiertes Reportergen verwenden, erfordern kostspielige Substratkits, ein Luminometer und entsprechende Software für die Analyse21. Dieser kolorimetrische Assay hat den Vorteil, dass nur ein Lichtmikroskop und ein sehr billiges Substrat benötigt werden. Die Berichterstattung über die Sensitivität von kolorimetrischen gegenüber lumineszierenden Assays hat zu widersprüchlichen Ergebnissen geführt. Eine Studie schlug vor, dass lumineszenzbasierte ELISA-Assays eine höhere Sensitivität und vergleichbare Reproduzierbarkeit wie kolorimetrische Assays aufweisen22, während eine andere studierte, dass kolorimetrische ELISA-Assays eine höhere Sensitivität verleihen23. Hier wird ein detailliertes Protokoll für einen In-vitro-NAb-Assay gegen AAV bereitgestellt, der die chromogene Reaktion zwischen einem AAV- kodierenden alkalischen Phosphatase (AP) -Reportergen und einem nitroblauen Tetrazolium / 5-Brom-4-Chlor-3-indolylphosphat (NBT / BCIP) -Substrat verwendet. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll wurde auf der Grundlage eines früheren Berichts entwickelt, der ein hPLAP-Reportergen (Human Placental Alkaline Phosphatase) (AAV6-hPLAP) verwendete, um die neutralisierende Aktivität gegen AAV24 nachzuweisen. Dieser Assay ist kostengünstig, zeiteffizient, einfach einzurichten und erfordert minimale technische Fähigkeiten, Laborgeräte und Reagenzien. Darüber hinaus bietet die Einfachheit dieses Assays das Potenzial, für breite Anwendungen in verschiedenen Arten von Zellen, Geweben oder viralen Serotypen optimiert zu werden.
Dieser Bericht beschreibt einen kolorimetrischen Assay, der das Ausmaß der AAV-Neutralisation in einer bestimmten Serumprobe bewertet, indem er eine chromogene Reaktion bewertet, die dem Grad der in vitro viralen Transduktion entspricht. Die Entwicklung des Protokolls basierte auf der bekannten chromogenen Reaktion zwischen dem Enzym alkalische Phosphatase und NBT/BCIP, die weithin als Färbewerkzeug für den Nachweis von Proteintargets in Anwendungen wie der Immunhistochemie und als Reporterwerkzeug zur Bewert…
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde durch einen Projektzuschuss des National Health and Medical Research Council für JRM und CJT (ID 1163732) und teilweise durch das Operational Infrastructure Support Program der viktorianischen Regierung finanziert. SB wird durch ein gemeinsames Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral Scholarship unterstützt. KLW wird von der Shine On Foundation und einem Future Leader Fellowship der National Heart Foundation of Australia (ID 102539) unterstützt. JRM wird durch ein Senior Research Fellowship (ID 1078985) des National Health and Medical Research Council unterstützt.
0.05% Trypsin/EDTA | Gibco | 25300-054 | |
50 mL conical centrifuge tube | Falcon | 14-432-22 | Or equivalent |
75 cm2 square flasks | Falcon | 353136 | Or equivalent |
96 well flat bottomed plate | Falcon | 353072 | |
AAV6-CMV-hPLAP Vector | Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request. | ||
Aluminium foil | |||
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) | PROGEN | 610159 | Positive control monoclonal antibody |
BCIP/NBT | SIGMAFAST | B5655 | |
Cell and tissue culture safety cabinet | |||
Electronic Pipette | 5 & 10 mL stripette inserts | ||
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099-141 | |
Haemocytometer | |||
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965118 | |
HT1080 cells | ATCC | ||
ImageJ Software | Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
Light microscope with camera | Capable of taking photos with a 4x objective lens | ||
Oven | For a 65 °C incubation | ||
Paraformaldehyde | MERCK | 30525-89-4 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phosphate buffered saline | |||
Pipettes and tips | 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette | ||
Stericup quick release filter | Millipore | S2GPU10RE | Used for combining media reagents |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator | Greiner BIO-ONE | 455071 | Used for serum collection & processing from sheep |
Water bath |