JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

שיטה שלב אחר שלב לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד AAV באמצעות בדיקה מבוססת תאים צבעוניים

Published: December 07, 2021
doi:
10.3791/63419
, , , , ,
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology,La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health,University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR),The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School,Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health,The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital,Monash University

Summary

תהליך עבודה מקיף של פרוטוקול מעבדה וניתוח מתוארים לבדיקה מהירה, חסכונית ופשוטה המבוססת על תאים צבעוניים כדי לזהות אלמנטים מנטרלים מול AAV6.

Abstract

וירוסים הקשורים אדנו רקומביננטי (rAAV) הוכיחו להיות וקטור בטוח ומוצלח להעברת חומר גנטי לטיפול במצבים בריאותיים שונים הן במעבדה והן במרפאה. עם זאת, נוגדנים מנטרלים קיימים (NAbs) נגד קפסידי AAV מהווים אתגר מתמשך לניהול מוצלח של טיפולים גנטיים הן במודלים ניסיוניים של בעלי חיים גדולים והן באוכלוסיות אנושיות. סינון ראשוני עבור חסינות מארח נגד AAV יש צורך להבטיח את היעילות של טיפולים גנטיים מבוססי AAV הן ככלי מחקר והן כסוכן טיפולי בר קיימא מבחינה קלינית. פרוטוקול זה מתאר בדיקת אין ויטרו צבעונית כדי לזהות גורמים מנטרלים מול סרוטיפ AAV 6 (AAV6). הבדיקה מנצלת את התגובה בין AAV קידוד גן פוספטאז אלקליין (AP) כתב ואת המצע שלה NBT / BCIP, אשר מייצר כתם סגול מסיס לכימות על שילוב.

בפרוטוקול זה, דגימות סרום משולבות עם AAV המביע AP ודגר כדי לאפשר פעילות נטרול פוטנציאלית להתרחש. תערובת סרום וירוס מתווסף לאחר מכן לתאים כדי לאפשר transduction ויראלי של כל AAVs שלא נוטרלו. מצע NBT/ BCIP מתווסף ועובר תגובה כרומוגנית, המתאימה לפעילות טרנסדוקציה ויראלית ונטרול. חלקו היחסי של האזור הצבעוני הוא כמות באמצעות כלי תוכנה חופשית כדי ליצור titers מנטרל. בדיקה זו מציגה מתאם חיובי חזק בין צבע לריכוז ויראלי. הערכת דגימות סרום מכבשים לפני ואחרי מתן AAV6 רקומביננטי הובילה לעלייה דרמטית בנטרול הפעילות (עלייה של פי 125 עד >10,000). הבדיקה הפגינה רגישות נאותה לזיהוי פעילות מנטרלת בדילול סרום >1:32,000. בדיקה זו מספקת שיטה פשוטה, מהירה וחסכונית לזיהוי NAbs נגד AAVs.

Introduction

וירוסים הקשורים אדנו (AAV) משמשים יותר ויותר וקטורים להעברת טיפולים גנטיים לטיפולים משפטיים עבור מצבים בריאותיים שונים המשפיעים על הלב וכלי הדם, הריאות, מחזור הדם, העין, ומערכות העצבים המרכזיות1,2,3,4,5. הפופולריות של וקטורים AAV כפלטפורמה מובילה לטיפול גנטי נובעת מפרופיל הבטיחות החיובי שלהם, ביטוי טרנסג’ן לטווח ארוך, וטרופיזם רחב היקף ספציפי לרקמות1,6. תוצאות מוצלחות במחקרים בבעלי חיים סללו את הדרך ליותר מחמישים ניסויים קליניים של טיפול גנטי AAV שהגיעו בהצלחה לנקודות הקצה של היעילות שלהם7, כמו גם את שחרורו של התרופה הראשונה לטיפול גנטי AAV הזמינה מסחרית שאושרה על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקאי8. בעקבות ההצלחות הראשוניות, AAV המשיכה לצבור תאוצה במגזרי המחקר הבסיסיים והקליניים כווקטור בחירה וכיום היא היחידה בטיפול הגנטי של vivo שאושר לשימוש קליני בארה”ב ובאירופה9. עם זאת, נוכחותם של נוגדנים מנטרלים קיימים (NAbs) נגד קפסידים וקטוריים של AAV נותרה מכשול הן למחקר הפרה-קליני והן ליעילות הניסויים הקליניים. NAbs נמצאים הן באוכלוסיות אנושיות נאיביות והן באוכלוסיות בעלי חיים ומעכבים את העברת הגנים בעקבות ניהול vivo של וקטור AAV1. AAV seropositivity הוא קריטריון בלעדיה עבור רוב הניסויים בריפוי גנטי, ולכן סינון ראשוני עבור חסינות מארח הוא קריטי הן במעבדה והן במרפאה. הקמת בדיקה שיכולה לזהות את נוכחותם של NAbs נגד AAV היא צעד חיוני בצנרת של כל פרויקט מחקר מבוסס טיפול גנטי AAV. דו”ח זה מתמקד AAV6 אשר כבר עניין לחוקרים בשל transduction יעיל וסלקטיבי שלה שריר מפוספס (שריר הלב והשלד)1,10,10,11,12. ריפוי גנטי נחשב אסטרטגיה מבטיחה למיקוד הלב כי קשה למקד באופן ספציפי את הלב ללא הליכי לב פתוח פולשניים.

נטרול פעילות נקבע בדרך כלל באמצעות או אין ויטרו מבוסס תא או in vivo transduction עיכוב בדיקה. In vivo בדיקות NAb כוללות בדרך כלל מתן סרום מנושא ניסוי (למשל, אדם או בעל חיים גדול) לעכברים, ואחריו AAV עם גן עיתונאי, ואחריו בדיקות לביטוי של הגן העיתונאי או אנטיגן מתאים. בדיקות במבחנה לקבוע NAb titers על ידי דגירה סרום או פלזמה מבעל חיים אנושי או גדול בדילולים סדרתיים עם AAV רקומביננטי (rAAV) המבטא גן עיתונאי. תאים נגועים בתערובת הסרום/ וירוס, ואת המידה שבה ביטוי הגנים הכתב הוא מוערך לעומת פקדים. בדיקות הפריה חוץ גופית נמצאות בשימוש נרחב להקרנת NAb בשל העלות הנמוכה יחסית שלהן, מהירות הבדיקות ויכולת גדולה יותר לתקנון ולאימות13,14 בהשוואה לבדיקות vivo. בבדיקות vivo מדווחים לעתים קרובות יש רגישות רבה יותר 15,16, אבל אותה טענה הועלתה לגבי בדיקות במבחנה 14,17.

עד כה, אין ויטרו NAb assays השתמשו בעיקר אור (לוציפראז) כגן הכתב כדי לזהות נטרול. למרות שלשיטה מבוססת אור יש ערך בהקשרים רבים, בדיקת NAb צבעונית/כרומוגנית עשויה להיות יתרון בנסיבות מסוימות. בדיקות צבעוניות להערכת נטרול הועסקו בהצלחה עבור וירוסים אחרים כגון שפעת ואדנווירוס18,19. האטרקטיביות שלהם נובעת מהפשטות שלהם, העלות הנמוכה יותר, והדרישה למנגנוני מעבדה וכלים יומיומיים בלבד20. בדיקות NAb המשתמשות בגן עיתונאי מבוסס זוהר דורשות ערכות מצע יקרות, לומינומטר ותוכנה מתאימה לניתוח21. בדיקה צבעונית זו יש את היתרון של רק צורך מיקרוסקופ אור ומצע זול מאוד. דיווח על הרגישות של בדיקות צבע לעומת זוהרות הניב תוצאות סותרות. מחקר אחד הציע בדיקות ELISA מבוססות אור להציג רגישות רבה יותר ושחזור דומה לבדיקות צבע22, בעוד אחר מצא צבע מבוסס ELISA בדיקות להעניק רגישות רבה יותר23. כאן, פרוטוקול מפורט עבור בדיקת במבחנה NAb נגד AAV המשתמש בתגובה הכרומוגנית בין AAV קידוד פוספטאז אלקליין (AP) גן כתב טטרזוליום כחול ניטרו /5-bromo-4-כלורו-3-indolyl פוספט (NBT / BCIP) מסופק. פרוטוקול שלב אחר שלב זה פותח בהתבסס על דו”ח קודם שהשתמש בגן עיתונאי hPLAP (פוספטאז אלקליין שליה אנושית) (AAV6-hPLAP) כדי לזהות נטרול פעילות נגד AAV24. בדיקה זו היא חסכונית, חסכונית בזמן, קלה להתקנה, ודורשת מיומנויות טכניות מינימליות, ציוד מעבדה ורגנטים. יתר על כן, הפשטות של בדיקה זו נותנת לו את הפוטנציאל להיות ממוטב עבור יישומים רחבים על פני סוגים שונים של תאים, רקמות, או סרוטיפים ויראליים.

Protocol

כל ההיבטים של טיפול בבעלי חיים וניסויים נערכו בעקבות הנחיות מכון פלורי למדעי המוח ובריאות הנפש והקוד האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות לאחר התייחסות25. מרינו ewes בן 1.5-3 שנים שימשו למחקר. סקירה סכמטית של פרוטוקול הבדיקה מסופקת באיור 1. <p class="jove_conte…

Representative Results

בדיקת Transduction כדי לקבוע את המינון הנגיפי האופטימלי לכיסוי צלחתתאי HT1080, קו תאי פיברוסרקומה מבוסס היטב, נבחרו לבדיקה זו. ריכוז של 1 x 104 HT1080 תאים / היטב סיפק ~ 50% מפגש תאים בכל באר של צלחת 96-well. כדי לקבוע את הריכוז הנגיפי האופטימלי עבור הבדיקה, rAAV קידוד hPLAP (פוספטאז אלקליין שליה אנו…

Discussion

דו”ח זה מתאר בדיקה צבעונית המעריכת את מידת נטרול AAV במדגם סרום נתון על ידי הערכת תגובה כרומוגנית המתאימה למידת התמרת הנגיף במבחנה. פיתוח הפרוטוקול התבסס על התגובה הכרומוגנית הידועה בין האנזים פוספטאז אלקליין לבין NBT/BCIP, אשר נעשה בו שימוש נרחב ככלי מכתים לאיתור מטרות חלבון ביישומים כגו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי מענק פרויקט המועצה הלאומית לבריאות ולמחקר רפואי ל- JRM ו- CJT (ID 1163732) ובחלקו על ידי תוכנית התמיכה בתשתיות תפעוליות של ממשלת ויקטוריה. SB נתמך על ידי מכון בייקר לב וסוכרת משותף-מלגת הדוקטורט של אוניברסיטת לה טרובה. KLW נתמכת על ידי קרן Shine On ומלגת מנהיג עתידית מקרן הלב הלאומית של אוסטרליה (ID 102539). JRM נתמך על ידי מלגת מחקר בכירה של המועצה הלאומית לבריאות ולמחקר רפואי (ID 1078985).

Materials

0.05% Trypsin/EDTA Gibco 25300-054
50 mL conical centrifuge tube Falcon 14-432-22 Or equivalent
75 cm2 square flasks Falcon 353136 Or equivalent
96 well flat bottomed plate Falcon 353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) PROGEN 610159 Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT SIGMAFAST B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette 5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum Gibco 10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965118
HT1080 cells ATCC
ImageJ Software Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator 37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde MERCK 30525-89-4
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter Millipore S2GPU10RE Used for combining media reagents
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator Greiner BIO-ONE 455071 Used for serum collection & processing from sheep
Water bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
  3. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16 (2018).
  4. Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
  5. Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
  6. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  7. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399 (2021).
  10. Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
  11. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  12. Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
  13. Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
  14. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  15. Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
  16. Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
  17. Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
  18. Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
  19. Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
  20. Xiaoli Zhu, T. G. . Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , 237-264 (2019).
  21. Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
  22. Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
  23. Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
  24. Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220 (2011).
  25. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013)
  26. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
  27. Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
  28. AAV-HT1080 Cells. Stratagene Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003)
  29. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
  30. Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538 (2013).
  31. Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627 (2012).
  32. Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3′,4′-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
  33. Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
  34. Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
  35. Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
  36. Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
  37. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  38. Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
  39. Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
  40. Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
  41. Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
  42. Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
  43. Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142 (2013).
  44. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
  45. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
  46. Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
  47. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
  48. Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
  49. Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
  50. Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).

Tags

Neutralizing AntibodiesAAV Gene TherapyColorimetric Cell-based AssayHT1080 CellsSerum DilutionsViral GenomeParaformaldehydeAlkaline PhosphataseBCIP/NBTMicroscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bass-Stringer, S., Thomas, C. J., May, C. N., Gregorevic, P., Weeks, K. L., McMullen, J. R. A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay. J. Vis. Exp. (178), e63419, doi:10.3791/63419 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image