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Um método passo-a-passo para detectar anticorpos neutralizantes contra a AAV usando um ensaio baseado em células coloridas

Published: December 07, 2021
doi:
10.3791/63419
, , , , ,
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology,La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health,University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR),The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School,Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health,The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital,Monash University

Summary

Um protocolo de laboratório abrangente e um fluxo de trabalho de análise são descritos para um ensaio rápido, econômico e simples baseado em células coloridas para detectar elementos neutralizantes contra o AAV6.

Abstract

Os vírus associados à adeno recombinante (rAAV) provaram ser um vetor seguro e bem sucedido para a transferência de material genético para tratar várias condições de saúde tanto no laboratório quanto na clínica. No entanto, anticorpos neutralizantes pré-existentes (NAbs) contra capsídeos AAV representam um desafio contínuo para a administração bem sucedida de terapias genéticas em grandes modelos experimentais animais e populações humanas. A triagem preliminar para a imunidade do hospedeiro contra a AAV é necessária para garantir a eficácia das terapias genéticas baseadas em AAV como ferramenta de pesquisa e como um agente terapêutico clinicamente viável. Este protocolo descreve um ensaio in vitro colorimétrico para detectar fatores neutralizantes contra o sorotipo AAV 6 (AAV6). O ensaio utiliza a reação entre um gene repórter de fosfatase alcalina (AP) e seu substrato NBT/BCIP, que gera uma mancha roxa quantificável insolúvel após a combinação.

Neste protocolo, as amostras de soro são combinadas com um AAV expressando AP e incubadas para permitir que possíveis atividades de neutralização ocorram. A mistura de soro do vírus é posteriormente adicionada às células para permitir a transdução viral de quaisquer AAVs que não tenham sido neutralizados. O substrato NBT/BCIP é adicionado e sofre uma reação cromogênica, correspondendo à transdução viral e atividade neutralizante. A proporção de área colorida é quantitatada usando uma ferramenta de software livre para gerar titulações neutralizadoras. Este ensaio mostra uma forte correlação positiva entre coloração e concentração viral. A avaliação de amostras de soro de ovelhas antes e depois da administração de um AAV6 recombinante levou a um aumento dramático na atividade neutralizante (aumento de 125 a >10.000 vezes). O ensaio apresentou sensibilidade adequada para detectar atividade neutralizante em diluições de soro >1:32.000. Este ensaio fornece um método simples, rápido e econômico para detectar NAbs contra AAVs.

Introduction

Os vírus associados ao Adeno (AAV) são cada vez mais utilizados como vetores para a entrega de terapias genéticas para tratamentos experimentais para várias condições de saúde que impactam os sistemas nervosos cardiovascular, pulmonar, circulatório, ocular e central1,2,3,4,5. A popularidade dos vetores AAV como uma plataforma líder de terapia genética decorre de seu perfil positivo de segurança, expressão transgênica de longo prazo e tropismos específicos de tecido amplo1,6. Resultados bem-sucedidos em estudos em animais abriram caminho para mais de cinquenta ensaios clínicos de terapia genética AAV que atingiram com sucesso seus pontos finais de eficácia7, bem como a liberação do primeiro medicamento comercialmente disponível de terapia genética AAV aprovado pela Food and Drug Administration8 dos EUA. Após os sucessos iniciais, a AAV continuou a ganhar tração nos setores de pesquisa básica e clínica como vetor de escolha e atualmente é a única terapia genética in vivo aprovada para uso clínico nos EUA e europa9. No entanto, a presença de anticorpos neutralizantes pré-existentes (NAbs) contra capsídeos vetoriais de AAV continua a ser um empecilho tanto para a pesquisa pré-clínica quanto para a eficácia dos ensaios clínicos. Os NAbs estão presentes em populações humanas e animais ingênuas e inibem a transdução genética após a administração in vivo de um vetor AAV1. A soropositividade AAV é um critério de exclusão para a maioria dos ensaios de terapia genética e, portanto, a triagem preliminar para imunidade hospedeira é crucial tanto no laboratório quanto na clínica. Estabelecer um ensaio que possa detectar a presença de NAbs contra AAV é um passo essencial no pipeline de qualquer projeto de pesquisa baseado em terapia genética AAV. Este relatório se concentra no AAV6, que tem sido de interesse dos pesquisadores devido à sua transdução eficiente e seletiva no músculo estriado (músculo cardíaco e esquelético)1,10,11,12. A terapia genética é considerada uma estratégia promissora para atingir o coração porque é difícil atingir especificamente o coração sem procedimentos invasivos de coração aberto.

A atividade neutralizante é geralmente determinada usando um ensaio de inibição de transdução in vitro ou in vivo. In vivo Os ensaios da NAb geralmente envolvem a administração de soro de um sujeito de teste (por exemplo, humano ou animal grande) em camundongos, seguido por um AAV com um gene repórter, seguido de testes para a expressão do gene repórter ou antígeno correspondente. Ensaios in vitro determinam os títulos de NAb incubando soro ou plasma de um animal humano ou grande em diluições seriais com um AAV recombinante (rAAV) que expressa um gene repórter. As células estão infectadas com a mistura soro/vírus, e até que ponto a expressão genética do repórter é inibida é avaliada em comparação com os controles. Ensaios in vitro são amplamente utilizados para a triagem de NAb devido ao seu custo relativamente menor, rapidez nos testes e maior capacidade de padronização e validação13,14 em comparação com ensaios in vivo. Ensaios in vivo são frequentemente relatados como ter maior sensibilidade15,16, mas a mesma alegação foi feita em relação aos ensaios in vitro14,17.

Até o momento, ensaios in vitro NAb têm usado principalmente luminescência (luciferase) como o gene repórter para detectar a neutralização. Embora um método baseado em luz tenha mérito em muitos contextos, um ensaio de NAb colorimétrico/cromogênico pode ser vantajoso em algumas circunstâncias. Os ensaios colorimétricos para avaliar a neutralização têm sido empregados com sucesso para outros vírus, como influenza e adenovírus18,19. Sua atratividade decorre de sua simplicidade, menor custo e exigência apenas de aparelhos e ferramentas de laboratório cotidianos20. Ensaios nab que usam um gene repórter baseado em luminescência requerem kits de substrato caros, um luminômetro e software correspondente para análise21. Este ensaio colorimétrico tem a vantagem de exigir apenas um microscópio leve e um substrato muito barato. O relato da sensibilidade dos ensaios colorimétricos versus luminescentes tem gerado resultados conflitantes. Um estudo sugeriu ensaios ELISA baseados em luminescência que mostram maior sensibilidade e reprodutibilidade comparável aos ensaios colorimétricos22, enquanto outro encontrou ensaios ELISA baseados em colorimetria para conferir maior sensibilidade23. Aqui, um protocolo detalhado para um ensaio in vitro NAb contra a AAV que utiliza a reação cromogênica entre um AAV codificando um gene repórter de fosfatase alcalina (AP) e um tetrazolium nitro azul /5-bromo-4-cloro-3-indol fosfato (NBT/BCIP) substrato é fornecido. Este protocolo passo-a-passo foi desenvolvido com base em um relatório anterior que utilizou um gene de repórter hPLAP (phosphatase alcalina da placenta humana) (AAV6-hPLAP) para detectar atividade neutralizante contra AAV24. Este ensaio é econômico, demorado, fácil de configurar e requer habilidades técnicas mínimas, equipamentos de laboratório e reagentes. Além disso, a simplicidade deste ensaio lhe dá o potencial de ser otimizado para aplicações amplas em diferentes tipos de células, tecidos ou sorotipos virais.

Protocol

Todos os aspectos do cuidado e experimentação animal foram conduzidos seguindo as diretrizes do Instituto Florey de Neurociência e Saúde Mental e o Código Australiano para o Cuidado e Uso de Animais para Fins Científicos após a Referência25. Foram utilizadas no estudo ovelhas Merino de 1,5 a 3 anos. Uma visão geral esquemática do protocolo de ensaio é fornecida na Figura 1. <img alt="Figure 1" cla…

Representative Results

Ensaio de transdução para estabelecer a dose viral ideal para cobertura de placasCélulas HT1080, uma linha celular fibrossarcoma bem estabelecida, foram selecionadas para este ensaio. Uma concentração de 1 x 104 células HT1080/bem fornecida ~50% de confluência celular em cada poço de uma placa de 96 poços. Para determinar a concentração viral ideal para o ensaio, um rAAV codificando um gene de repórter hPLAP (alcalina alcalina da placenta humana) (AAV6-hPLAP)3…

Discussion

Este relatório descreve um ensaio colorimétrico que avalia a extensão da neutralização da AAV em uma determinada amostra de soro, avaliando uma reação cromogênica correspondente ao grau de transdução viral in vitro. O desenvolvimento do protocolo foi baseado na reação cromogênica conhecida entre a enzima fosfatista e nbt/BCIP, que tem sido amplamente utilizada como ferramenta de coloração para a detecção de alvos proteicos em aplicações como a imunohistoquímica e como ferramenta repórter par…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi financiado por um Projeto do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica para a JRM e CJT (ID 1163732) e, em parte, pelo Programa de Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo Vitoriano. A SB é apoiada por uma bolsa conjunta de doutorado do Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University. A KLW é apoiada pela The Shine On Foundation e uma Future Leader Fellowship da National Heart Foundation of Australia (ID 102539). A JRM é apoiada por uma Bolsa Sênior de Pesquisa do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (ID 1078985).

Materials

0.05% Trypsin/EDTA Gibco 25300-054
50 mL conical centrifuge tube Falcon 14-432-22 Or equivalent
75 cm2 square flasks Falcon 353136 Or equivalent
96 well flat bottomed plate Falcon 353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) PROGEN 610159 Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT SIGMAFAST B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette 5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum Gibco 10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965118
HT1080 cells ATCC
ImageJ Software Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator 37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde MERCK 30525-89-4
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter Millipore S2GPU10RE Used for combining media reagents
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator Greiner BIO-ONE 455071 Used for serum collection & processing from sheep
Water bath
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References

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Bass-Stringer, S., Thomas, C. J., May, C. N., Gregorevic, P., Weeks, K. L., McMullen, J. R. A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay. J. Vis. Exp. (178), e63419, doi:10.3791/63419 (2021).
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