JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

طريقة خطوة بخطوة للكشف عن الأجسام المضادة المحايدة ضد AAV باستخدام فحص قائم على الخلايا اللونية

Published: December 07, 2021
doi:
10.3791/63419
, , , , ,
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology,La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health,University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR),The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School,Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health,The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital,Monash University

Summary

يتم وصف بروتوكول المختبر الشامل وسير عمل التحليل لإجراء فحص سريع وفعال من حيث التكلفة ومباشر قائم على الخلايا اللونية للكشف عن العناصر المحايدة ضد AAV6.

Abstract

أثبتت الفيروسات المرتبطة بالغدية المؤتلفة (rAAV) أنها ناقل آمن وناجح لنقل المواد الوراثية لعلاج مختلف الحالات الصحية في كل من المختبر والعيادة. ومع ذلك ، فإن الأجسام المضادة المحايدة الموجودة مسبقا (NAbs) ضد قفيصات AAV تشكل تحديا مستمرا للإدارة الناجحة للعلاجات الجينية في كل من النماذج التجريبية الحيوانية الكبيرة والمجموعات البشرية. يعد الفحص الأولي لمناعة المضيف ضد AAV ضروريا لضمان فعالية العلاجات الجينية القائمة على AAV كأداة بحثية وكعامل علاجي قابل للتطبيق سريريا. يصف هذا البروتوكول مقايسة قياس الألوان في المختبر للكشف عن العوامل المحايدة ضد النمط المصلي AAV 6 (AAV6). يستخدم الفحص التفاعل بين AAV الذي يشفر جين مراسل الفوسفاتيز القلوي (AP) وركيزته NBT / BCIP ، والتي تولد وصمة أرجوانية غير قابلة للذوبان كميا عند الجمع.

في هذا البروتوكول ، يتم دمج عينات المصل مع AAV الذي يعبر عن AP ويتم احتضانه للسماح بحدوث نشاط تحييد محتمل. يضاف خليط مصل الفيروسات لاحقا إلى الخلايا للسماح بالنقل الفيروسي لأي AAVs لم يتم تحييدها. تتم إضافة الركيزة NBT / BCIP وتخضع لتفاعل كروموجيني ، يتوافق مع النقل الفيروسي ونشاط التحييد. يتم تحديد نسبة المساحة الملونة باستخدام أداة برمجية حرة لإنشاء عيارات محايدة. يظهر هذا الفحص علاقة إيجابية قوية بين التلوين والتركيز الفيروسي. أدى تقييم عينات المصل من الأغنام قبل وبعد إعطاء AAV6 المؤتلف إلى زيادة كبيرة في نشاط التحييد (125 إلى > زيادة قدرها 10000 ضعف). أظهر الفحص حساسية كافية للكشف عن النشاط المحايد في >1:32,000 تخفيف المصل. يوفر هذا الفحص طريقة بسيطة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة للكشف عن NAbs ضد AAVs.

Introduction

تستخدم الفيروسات المرتبطة بالأغينو (AAV) بشكل متزايد كناقلات لتوصيل العلاجات الجينية إلى العلاجات التجريبية لمختلف الحالات الصحية التي تؤثر على الجهاز القلبي الوعائي والرئوي والدورة الدموية والعينية والجهاز العصبي المركزي1،2،3،4،5. تنبع شعبية ناقلات AAV كمنصة رائدة للعلاج الجيني من ملف تعريف السلامة الإيجابي الخاص بها ، والتعبير الجيني المتحول على المدى الطويل ، والاستوائيات الخاصة بالأنسجة واسعة النطاق1,6. وقد مهدت النتائج الناجحة في الدراسات التي أجريت على الحيوانات الطريق لأكثر من خمسين تجربة سريرية للعلاج الجيني AAV وصلت بنجاح إلى نقاط نهاية فعاليتها7، فضلا عن إطلاق أول دواء متاح تجاريا للعلاج الجيني AAV معتمد من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية8. بعد النجاحات الأولية ، واصلت AAV اكتساب قوة دفع في قطاعات البحوث الأساسية والسريرية كناقل مفضل وهي حاليا العلاج الجيني الوحيد في الجسم الحي المعتمد للاستخدام السريري في الولايات المتحدة وأوروبا9. ومع ذلك، فإن وجود أجسام مضادة محايدة موجودة مسبقا (NAbs) ضد قفيصات ناقلات AAV لا يزال يشكل عائقا أمام كل من البحوث قبل السريرية وفعالية التجارب السريرية. وتوجد NAbs في كل من المجموعات البشرية والحيوانية الساذجة وتمنع نقل الجينات بعد إعطاء ناقل AAV في الجسم الحي1. الإيجابية المصلية AAV هي معيار استبعاد لمعظم تجارب العلاج الجيني ، وبالتالي فإن الفحص الأولي لمناعة المضيف أمر بالغ الأهمية في كل من المختبر والعيادة. يعد إنشاء فحص يمكنه اكتشاف وجود NAbs ضد AAV خطوة أساسية في خط أنابيب أي مشروع بحثي قائم على العلاج الجيني AAV. يركز هذا التقرير على AAV6 الذي كان موضع اهتمام الباحثين بسبب نقله الفعال والانتقائي في العضلات المخططة (القلب والعضلات الهيكلية)1،10،11،12. يعتبر العلاج الجيني استراتيجية واعدة لاستهداف القلب لأنه من الصعب استهداف القلب على وجه التحديد دون إجراءات القلب المفتوح الغازية.

عادة ما يتم تحديد نشاط التحييد باستخدام إما اختبار تثبيط النقل القائم على الخلايا في المختبر أو في الجسم الحي. في الجسم الحي عادة ما تتضمن اختبارات NAb إعطاء مصل من موضوع اختبار (على سبيل المثال ، إنسان أو كبير) إلى الفئران ، يليه AAV مع جين مراسل ، يليه اختبار للتعبير عن جين المراسل أو المستضد المقابل. تحدد الفحوص المخبرية عيارات NAb عن طريق احتضان المصل أو البلازما من إنسان أو كبير في تخفيفات تسلسلية باستخدام AAV المؤتلف (rAAV) الذي يعبر عن جين مراسل. الخلايا مصابة بخليط المصل / الفيروس ، ويتم تقييم مدى تثبيط التعبير الجيني للمراسل مقارنة بالضوابط. تستخدم الفحوصات في المختبر على نطاق واسع لفحص NAb بسبب تكلفتها المنخفضة نسبيا ، والسرعة في الاختبار ، والقدرة الأكبر على التوحيد القياسي والتحقق من الصحة 13,14 مقارنة بالفحوصات في الجسم الحي. غالبا ما يتم الإبلاغ عن أن الفحوصات في الجسم الحي لها حساسية أكبر15،16 ، ولكن تم تقديم نفس الادعاء فيما يتعلق بالمقايسات في المختبر14،17.

حتى الآن ، استخدمت اختبارات NAb في المختبر بشكل أساسي التلألؤ (luciferase) كجين مراسل للكشف عن التحييد. على الرغم من أن الطريقة القائمة على الضوء لها ميزة في العديد من السياقات ، إلا أن اختبار NAb اللوني / اللوني قد يكون مفيدا في بعض الظروف. تم استخدام المقايسات اللونية لتقييم التحييد بنجاح لفيروسات أخرى مثل الأنفلونزا والفيروسات الغدية18,19. وتنبع جاذبيتها من بساطتها وانخفاض تكلفتها والحاجة إلى أجهزة وأدوات مختبرية يومية فقط20. تتطلب مقايسات NAb التي تستخدم جين مراسل قائم على التلألؤ مجموعات ركيزة باهظة الثمن ومقياس لمعان وبرامج مقابلة للتحليل21. يتميز هذا الفحص اللوني بأنه يتطلب فقط مجهرا ضوئيا وركيزة رخيصة جدا. وقد أسفر الإبلاغ عن حساسية المقايسات اللونية مقابل المضيئة عن نتائج متضاربة. اقترحت إحدى الدراسات أن اختبارات ELISA القائمة على التلألؤ تعرض حساسية أكبر وقابلية تكرار مماثلة لمقايسات قياس الألوان22 ، في حين وجدت دراسة أخرى أن اختبارات ELISA القائمة على القياس اللوني تضفي حساسية أكبر23. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل لفحص NAb في المختبر ضد AAV يستخدم التفاعل الكروموجيني بين AAV الذي يشفر جين مراسل الفوسفاتيز القلوي (AP) ورباعي التيتانوليوم الأزرق النيترو / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (NBT / BCIP). تم تطوير هذا البروتوكول خطوة بخطوة استنادا إلى تقرير سابق استخدم جين مراسل hPLAP (الفوسفاتيز القلوي للمشيمة البشرية) (AAV6-hPLAP) للكشف عن النشاط المحايد ضد AAV24. هذا الفحص فعال من حيث التكلفة ، وفعال من حيث الوقت ، وسهل الإعداد ، ويتطلب الحد الأدنى من المهارات التقنية والمعدات المختبرية والكواشف. علاوة على ذلك ، فإن بساطة هذا الفحص تمنحه إمكانية تحسينه للتطبيقات الواسعة عبر أنواع مختلفة من الخلايا أو الأنسجة أو الأنماط المصلية الفيروسية.

Protocol

أجريت جميع جوانب رعاية الحيوانات والتجارب وفقا لمعهد فلوري للعلوم العصبية والمبادئ التوجيهية للصحة العقلية والقانون الأسترالي لرعاية واستخدام الحيوانات للأغراض العلمية بعد المرجع 25. تم استخدام نعاج ميرينو البالغة من العمر 1.5-3 سنوات للدراسة. ويرد في الشكل 1 ?…

Representative Results

فحص النقل لتحديد الجرعة الفيروسية المثلى لتغطية اللوحةتم اختيار خلايا HT1080 ، وهي خط خلايا الساركوما الليفية الراسخ ، لهذا الفحص. تركيز 1 × 104 HT1080 خلية / بئر قدمت ~ 50٪ التقاء الخلايا في كل بئر من لوحة 96 بئر. لتحديد التركيز الفيروسي الأمثل للفحص، تمت إضافة rAAV ترميز جين مراسل hPLAP …

Discussion

يصف هذا التقرير مقايسة لونية تقيم مدى تحييد AAV في عينة مصل معينة من خلال تقييم تفاعل كروموجيني يتوافق مع درجة النقل الفيروسي في المختبر. استند تطوير البروتوكول إلى التفاعل اللوني المعروف بين إنزيم الفوسفاتيز القلوي و NBT / BCIP ، والذي تم استخدامه على نطاق واسع كأداة تلطيخ للكشف عن أهداف ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذه الدراسة من خلال منحة مشروع المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية إلى JRM و CJT (ID 1163732) وجزئيا من قبل برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية التابع لحكومة فيكتوريا. يتم دعم SB من خلال منحة دكتوراه مشتركة بين معهد بيكر للقلب والسكري وجامعة لا تروب. يتم دعم KLW من قبل مؤسسة Shine On Foundation وزمالة قادة المستقبل من مؤسسة القلب الوطنية الأسترالية (ID 102539). يتم دعم JRM من قبل زمالة أبحاث عليا من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (ID 1078985).

Materials

0.05% Trypsin/EDTA Gibco 25300-054
50 mL conical centrifuge tube Falcon 14-432-22 Or equivalent
75 cm2 square flasks Falcon 353136 Or equivalent
96 well flat bottomed plate Falcon 353072
AAV6-CMV-hPLAP Vector Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP can be provided upon request.
Aluminium foil
Anti-AAV6 (intact particle) mouse monoclonal antibody, (ADK6) PROGEN 610159 Positive control monoclonal antibody
BCIP/NBT SIGMAFAST B5655
Cell and tissue culture safety cabinet
Electronic Pipette 5 & 10 mL stripette inserts
Fetal Bovine Serum Gibco 10099-141
Haemocytometer
High glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965118
HT1080 cells ATCC
ImageJ Software Freely available: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator 37 °C, 5% CO2
Light microscope with camera Capable of taking photos with a 4x objective lens
Oven For a 65 °C incubation
Paraformaldehyde MERCK 30525-89-4
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Phosphate buffered saline
Pipettes and tips 20 μL, 200 μL & 1 mL single pipettes and tips & 200 μL multichannel pipette
Stericup quick release filter Millipore S2GPU10RE Used for combining media reagents
Trypan blue solution Sigma-Aldrich T8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Clot Activator Greiner BIO-ONE 455071 Used for serum collection & processing from sheep
Water bath
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
  3. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16 (2018).
  4. Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
  5. Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
  6. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  7. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399 (2021).
  10. Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
  11. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  12. Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
  13. Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
  14. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  15. Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
  16. Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
  17. Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
  18. Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
  19. Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
  20. Xiaoli Zhu, T. G. . Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , 237-264 (2019).
  21. Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
  22. Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
  23. Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
  24. Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220 (2011).
  25. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013)
  26. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
  27. Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
  28. AAV-HT1080 Cells. Stratagene Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003)
  29. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
  30. Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538 (2013).
  31. Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627 (2012).
  32. Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3′,4′-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
  33. Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
  34. Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
  35. Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
  36. Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
  37. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  38. Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
  39. Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
  40. Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
  41. Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
  42. Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
  43. Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142 (2013).
  44. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
  45. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
  46. Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
  47. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
  48. Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
  49. Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
  50. Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).

Tags

Neutralizing AntibodiesAAV Gene TherapyColorimetric Cell-based AssayHT1080 CellsSerum DilutionsViral GenomeParaformaldehydeAlkaline PhosphataseBCIP/NBTMicroscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bass-Stringer, S., Thomas, C. J., May, C. N., Gregorevic, P., Weeks, K. L., McMullen, J. R. A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay. J. Vis. Exp. (178), e63419, doi:10.3791/63419 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image