Hassas Tıp Araçları Olarak Mesane Kanseri Organoidleri Kültürü
Summary
Hasta kaynaklı organoidler (PDO’lar), translasyonel kanser araştırmalarında, hastalığın hem genetik hem de fenotipik heterojenliğini ve kişiselleştirilmiş anti-kanser tedavilerine yanıtı yansıtan güçlü bir araçtır. Burada, fenotipik analizlerin ve ilaç yanıtlarının değerlendirilmesine hazırlık olarak insan primer mesane kanseri PDO’ları üretmek için konsolide bir protokol detaylandırılmıştır.
Abstract
Mevcut in vitro terapötik test platformları, tipik olarak doku kültürü plastiği üzerinde iki boyutlu (2D) kültürler olarak kurulan kanser hücre hatlarını kullanan tümör patofizyolojisi ile ilgisizdir. Terapötik yanıtı ve duyarlılığı doğru bir şekilde tahmin edebilen daha temsili tümör karmaşıklığı modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Taze tümör dokularından türetilen hasta kaynaklı organoidlerin (PDO’lar) üç boyutlu (3D) ex vivo kültürünün geliştirilmesi, bu eksiklikleri gidermeyi amaçlamaktadır. Organoid kültürler, potansiyel etkili müdahaleleri tanımlayarak ve yararsız olabilecek tedavileri belirterek terapötik kararları bilgilendirmek için rutin klinik yönetime paralel olarak tümör vekilleri olarak kullanılabilir. Burada, bu prosedür, taze, canlı klinik dokudan mesane kanseri PDO’larını oluşturmak için stratejileri ve ayrıntılı bir adım adım protokolü tanımlamayı amaçlamaktadır. İyi kurulmuş, optimize edilmiş protokollerimiz, doğrudan hastalardan veya hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) tümör materyalinden sınırlı ve çeşitli başlangıç materyali kullanarak deneyler için 3D kültürler oluşturmak için pratiktir. Bu prosedür, standart doku kültürü ekipmanı ile donatılmış çoğu laboratuvar tarafından da kullanılabilir. Bu protokol kullanılarak üretilen organoidler, hem ürolojik kanser patolojisini destekleyen moleküler mekanizmaları anlamak hem de klinik yönetimi bilgilendirmek için tedavileri değerlendirmek için ex vivo vekiller olarak kullanılabilir.
Introduction
Mesane kanseri tüm dünyada en sık görülen üriner sistem kanseri ve onuncu en sık görülen insan malignitesidir1. Genetik olarak çeşitli ve fenotipik olarak karmaşık bir hastalık spektrumunu kapsar2. Mesane kanserinin ürotelyal non-kas invaziv formları (NMIBC) en sık görülen mesane kanseri tanılarıdır (%70-%80) ve bu kanserler önemli biyolojik heterojenite ve değişken klinik sonuçlar gösterir 2,3,4. NMIBC’li hastalar tipik olarak yüksek hastalık nüks riski (% 50-70) yaşarlar ve kanserlerin üçte biri önemli ölçüde daha agresif kas invaziv mesane kanserine (MIBC) ilerler ve gelişir2. NMIBC için 5 yıllık sağkalım oranları yüksek olmasına rağmen (%>90), bu hastalar uzun süreli klinik yönetime tabi tutulmalıdır5. Öte yandan, lokal olarak ilerlemiş (rezeke edilemez) veya metastatik MIBC genellikle tedavi edilemez olarak kabul edilir6. Sonuç olarak, mesane kanseri, kanser bakımı içinde en yüksek yaşam boyu tedavi maliyetlerinden birine sahiptir ve hem birey hem de sağlık sistemi için önemli bir yüktür 3,7. İleri evre hastalıkta altta yatan genetik anormallikler, mesane kanserinin terapötik yönetimini klinik bir zorluk haline getirmektedir ve invaziv ürotelyal tümörler için terapötik seçenekler, hem ileri hem de yüksek riskli NMIBC 8,9 için immünoterapilerin onaylanmasından bu yana yakın zamanda gelişmiştir. Günümüzde klinik karar verme, bireysel mesane kanseri tümörlerinin hastalık agresifliği ve tedaviye yanıtta büyük farklılıklar göstermesine rağmen, konvansiyonel klinik ve histopatolojik özelliklerle yönlendirilmektedir10. Bireysel hasta prognozunun tahminini ve etkili tedavilerin tanımlanmasını iyileştirmek için klinik olarak yararlı modellere yönelik araştırmaların hızlandırılmasına acil bir ihtiyaç vardır.
Üç boyutlu (3D) organoidler, orijinal tümörün içsel in vivo mimarisini ve farmakogenomik profilini kendi kendine organize etme ve özetleme yetenekleri ve türetildikleri orijinal dokunun doğal hücresel işlevselliğini yansıtma yetenekleri nedeniyle tümör modelleri olarak büyük potansiyel göstermektedir11,12,13 . Yerleşik mesane kanseri hücre hatları kolayca bulunabilse de, nispeten uygun maliyetli, ölçeklenebilir ve manipüle edilmesi basit olmasına rağmen, in vitro hücre hatları klinik mesane kanserlerinde gözlenen çeşitli genetik ve epigenetik değişikliklerin spektrumunu taklit etmekte büyük ölçüde başarısız olmuştur12,14 ve hepsi 2D, bağlı kültür koşulları altında kurulmuş ve sürdürülmüştür. Ek olarak, primer ve metastatik mesane tümörlerinden türetilen hücre hatları, orijinal tümör materyalinden önemli genetik ayrışma barındırmaktadır. 8,15.
Alternatif bir yaklaşım, genetiği değiştirilmiş ve kanserojen kaynaklı fare modellerini kullanmaktır. Bununla birlikte, bu modeller insan neoplazisinde yer alan bazı doğal onkojenik kaskadları özetlerken (refs 16,17,18’de gözden geçirilmiştir), tümör heterojenliğinden yoksundurlar, pahalıdırlar, invaziv ve metastatik mesane kanserini zayıf bir şekilde temsil ederler ve tümörlerin gelişmesi aylar sürebileceğinden hızlı süreli ilaç testi için uygun değildirler14,19 . Hasta kaynaklı kanser modelleri (organoidler, şartlı olarak yeniden programlanmış birincil hücre kültürü ve ksenogreftler dahil), klinik tedaviden önce ilaç tedavisinin etkilerini anlamak için paha biçilmez fırsatlar sunar20. Buna rağmen, az sayıda grup, taze primer hasta dokusuna sınırlı erişim ve hasta kaynaklı organoid (PDO) kültür koşullarını çoğaltılabilir bir şekilde üretmek için gereken kapsamlı optimizasyon nedeniyle bu hasta-proksimal modelleri rutin olarak kullanmaktadır. In vivo bir ortamda, onkojenik hücreler, stromal hücreler, bağışıklık hücrelerine sızan doku ve matris12 dahil olmak üzere çevredeki bileşenlerin çeşitli bileşimleriyle etkileşime girebilir ve iletişim kurabilir. Benzer şekilde, 3B formatında yetiştirilen PDO’lar için, hücresel/matris karmaşıklığı diğer ilgili bileşenleri içerecek şekilde özelleştirilebilir. PDO’lar hızlı bir şekilde üretilebilir ve21,22,23 sonlu bir ömre sahip olmasına rağmen, genellikle yaygın olarak geçirilebilir veya daha sonra kullanılmak üzere kriyokorunabilir. Farmakodinamik (yani, bir ilaca yanıt), organoid canlılık ve morfoloji ve immünohistokimya hedeflerinin veya transkripsiyonel değişikliklerin karakterizasyonu dahil olmak üzere çoklu okumalar kullanılarak değerlendirilebilir.
Burada, mesane tümörünün transüretral rezeksiyonundan (TURBT) toplanan hasta materyalinden mesane kanseri organoidlerinin kurulması veya mesanenin cerrahi olarak çıkarılması (radikal sistektomi) prosedürleri açıklanmaktadır. PDO’ları üretme yöntemi, hazır bulunan ıslak laboratuvar malzemeleri ve araçları kullanılarak gösterilmiştir. Son noktalar, hücre morfolojik özelliklerindeki ve canlılığındaki değişiklikleri içerir. Bunlar floresan mikroskopi, in vitro canlılık (metabolik ve hücre zarı bütünlüğü) testleri ve histopatolojik analiz kullanılarak ölçüldü. Şekil 1 , elektif cerrahi sırasında elde edilen klinik materyalden insan mesane kanseri PDO’larının kurulması için iş akışını göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mesane kanseri dokusundan türetilen 3D organoid protokoller henüz bebeklik döneminde olmakla birlikte, aktif bir araştırma ve klinik araştırma alanıdır. Burada, hem NMIBC hem de MIBC örnekleri için uygun olan mesane kanseri PDO’larını başarılı bir şekilde oluşturmak için optimize edilmiş bir protokol detaylandırılmıştır. Bu iş akışı, hastane tabanlı klinik çalışmalara paralel olarak entegre olur ve klinik organoid boru hatları için önemli bir husus olan histolojik numune işleme ve taz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Translasyonel Araştırma Enstitüsü Histoloji çekirdek ve Biyolojik Kaynak Tesisi’nin teknik yardımını kabul ediyoruz. Bu araştırma, Prenses Alexandra Araştırma Vakfı ödülü (I.V., E.D.W.) ve Tıbbi Araştırma Gelecek Fonu (MRFF) Hızlı Uygulamalı Araştırma Çeviri Programı (Kanserlerin Kişiselleştirilmiş Analizi Merkezi (CPAC; E.D.W., I.V.). Translasyonel Araştırma Enstitüsü, Avustralya Hükümeti’nden destek almaktadır.
Materials
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
- Saginala, K., et al. Epidemiology of bladder cancer. Medical Sciences. 8 (1), 15 (2020).
- Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
- Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
- Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
- Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
- Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
- Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
- Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer – the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
- Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
- Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
- Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
- Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
- Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).
