Kultur von Blasenkrebs-Organoiden als Werkzeuge der Präzisionsmedizin
Summary
Patientenabgeleitete Organoide (PDOs) sind ein leistungsfähiges Werkzeug in der translationalen Krebsforschung, das sowohl die genetische als auch die phänotypische Heterogenität der Krankheit und das Ansprechen auf personalisierte Krebstherapien widerspiegelt. Hier wird ein konsolidiertes Protokoll zur Erzeugung von PDOs für primären Blasenkrebs beim Menschen in Vorbereitung auf die Bewertung von phänotypischen Analysen und Arzneimittelreaktionen detailliert beschrieben.
Abstract
Aktuelle therapeutische In-vitro-Testplattformen haben keine Relevanz für die Tumorpathophysiologie, da sie typischerweise Krebszelllinien verwenden, die als zweidimensionale (2D) Kulturen auf Gewebekulturplastik etabliert sind. Es besteht ein kritischer Bedarf an repräsentativeren Modellen der Tumorkomplexität, die das therapeutische Ansprechen und die Sensitivität genau vorhersagen können. Die Entwicklung einer dreidimensionalen (3D) Ex-vivo-Kultur von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs), die aus frischem Tumorgewebe gewonnen werden, zielt darauf ab, diese Mängel zu beheben. Organoidkulturen können parallel zum routinemäßigen klinischen Management als Tumorsurrogate verwendet werden, um therapeutische Entscheidungen zu treffen, indem potenziell wirksame Interventionen identifiziert und Therapien angezeigt werden, die möglicherweise nutzlos sind. Hier zielt dieses Verfahren darauf ab, Strategien und ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zu beschreiben, um Blasenkrebs-PDOs aus frischem, lebensfähigem klinischem Gewebe zu etablieren. Unsere gut etablierten, optimierten Protokolle sind praktisch, um 3D-Kulturen für Experimente mit begrenztem und vielfältigem Ausgangsmaterial direkt aus Patienten oder patientenabgeleitetem Xenotransplantat-Tumormaterial (PDX) einzurichten. Dieses Verfahren kann auch von den meisten Labors angewendet werden, die mit Standard-Gewebekulturgeräten ausgestattet sind. Die mit diesem Protokoll erzeugten Organoide können als Ex-vivo-Surrogate verwendet werden, um sowohl die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der urologischen Krebspathologie zugrunde liegen, als auch Behandlungen zu bewerten, um das klinische Management zu informieren.
Introduction
Blasenkrebs ist der am weitesten verbreitete Harnwegskrebs und der zehnthäufigste menschliche Malignitätskarzinom weltweit1. Es umfasst ein genetisch vielfältiges und phänotypisch komplexes Krankheitsspektrum2. Urotheliale nicht-muskel-invasive Formen von Blasenkrebs (NMIBC) sind die häufigsten Blasenkrebsdiagnosen (70%-80%), und diese Krebsarten weisen eine beträchtliche biologische Heterogenität und variable klinische Ergebnisseauf 2,3,4. Patienten mit NMIBC haben typischerweise ein hohes Risiko für ein Wiederauftreten der Krankheit (50-70%) und ein Drittel der Krebserkrankungen wird fortschreiten und sich zu signifikant aggressiverem muskelinvasivem Blasenkrebs (MIBC) entwickeln2. Obwohl die 5-Jahres-Überlebensraten für NMIBC hoch sind (>90%), müssen sich diese Patienten einem langfristigen klinischen Managementunterziehen 5. Auf der anderen Seite wird lokal fortgeschrittene (insektierbare) oder metastasierende MIBC im Allgemeinen als unheilbarangesehen 6. Folglich hat Blasenkrebs eine der höchsten lebenslangen Behandlungskosten in der Krebsbehandlung und ist eine erhebliche Belastung sowohl für den Einzelnen als auch für das Gesundheitssystem 3,7. Die zugrunde liegenden genetischen Aberrationen bei fortgeschrittenen Erkrankungen machen die therapeutische Behandlung von Blasenkrebs zu einer klinischen Herausforderung, und die therapeutischen Optionen für invasive Urotheltumoren haben sich erst kürzlich seit der Zulassung von Immuntherapien für fortgeschrittene und Hochrisiko-NMIBC 8,9 verbessert. Derzeit wird die klinische Entscheidungsfindung von konventionellen klinischen und histopathologischen Merkmalen geleitet, obwohl einzelne Blasenkrebstumoren große Unterschiede in der Krankheitsaggressivität und dem Ansprechen auf die Therapiezeigen 10. Es ist dringend notwendig, die Erforschung klinisch nützlicher Modelle zu beschleunigen, um die Vorhersage der individuellen Patientenprognose und die Identifizierung wirksamer Behandlungen zu verbessern.
Dreidimensionale (3D) Organoide zeigen ein großes Potenzial als Tumormodelle aufgrund ihrer Fähigkeit, die intrinsische In-vivo-Architektur und das pharmakogenomische Profil des ursprünglichen Tumors selbst zu organisieren und zu rekapitulieren, und ihrer Fähigkeit, die native zelluläre Funktionalität des ursprünglichen Gewebes, aus dem sie abgeleitet wurden, zu spiegeln11,12,13 . Obwohl etablierte Blasenkrebs-Zelllinien leicht verfügbar, relativ kostengünstig, skalierbar und einfach zu manipulieren sind, können die In-vitro-Zelllinien das Spektrum verschiedener genetischer und epigenetischer Veränderungen, die bei klinischen Blasenkrebserkrankungen beobachtet wurden, weitgehend nicht nachahmen12,14 und wurden alle unter 2D-, adhärenten Kulturbedingungen etabliert und aufrechterhalten. Darüber hinaus weisen Zelllinien, die von primären und metastasierten Blasentumoren stammen, eine signifikante genetische Divergenz vom ursprünglichen Tumormaterial auf. 8,15
Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung gentechnisch veränderter und karzinogeninduzierter Mausmodelle. Während diese Modelle jedoch einige der natürlichen onkogenen Kaskaden rekapitulieren, die an der menschlichen Neoplasie beteiligt sind (überprüft in Refs 16, 17, 18), fehlt es ihnen an Tumorheterogenität, sie sind teuer, stellen invasiven und metastasierenden Blasenkrebs schlecht dar und sind nicht für schnelle Medikamententests geeignet, da die Entwicklung von Tumoren viele Monate dauern kann 14,19 . Von Patienten abgeleitete Krebsmodelle (einschließlich Organoide, bedingt umprogrammierte primäre Zellkultur und Xenotransplantate) bieten unschätzbare Möglichkeiten, die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung vor der klinischen Behandlungzu verstehen 20. Trotzdem verwenden nur wenige Gruppen routinemäßig diese patientenproximalen Modelle, da der Zugang zu frischem primärem Patientengewebe begrenzt ist und eine umfassende Optimierung erforderlich ist, um reproduzierbare Bedingungen für die Kultur von Patienten abgeleitete Organoide (PDO) zu erzeugen. In einer In-vivo-Umgebung können onkogene Zellen mit verschiedenen Zusammensetzungen der umgebenden Bestandteile interagieren und kommunizieren, einschließlich Stromazellen, gewebeinfiltrierende Immunzellen und Matrix12. In ähnlicher Weise kann bei PDOs, die in einem 3D-Format gezüchtet werden, die Zell-/Matrixkomplexität angepasst werden, um andere relevante Komponenten einzubeziehen. PDOs können schnell erzeugt werden und können oft extensiv durchgelassen oder für die spätere Verwendung kryokonserviert werden, obwohl sie eine begrenzte Lebensdauervon 21,22,23 haben. Die Pharmakodynamik (d. h. das Ansprechen auf ein Arzneimittel) kann anhand mehrerer Auslesungen bewertet werden, einschließlich der Organoidlebensfähigkeit und -morphologie sowie der Charakterisierung von immunhistochemischen Zielen oder transkriptionellen Veränderungen.
Hier werden die Verfahren zur Etablierung von Blasenkrebs-Organoiden aus Patientenmaterial beschrieben, das bei der transurethralen Resektion von Blasentumoren (TURBT) oder der chirurgischen Entfernung der Blase (radikale Zystektomie) gesammelt wurde. Die Methode zur Generierung von g.U. wird unter Verwendung leicht verfügbarer nasser Labormaterialien und -werkzeuge veranschaulicht. Endpunkte sind Veränderungen der morphologischen Eigenschaften und der Lebensfähigkeit der Zellen. Diese wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie, In-vitro-Lebensfähigkeit (metabolische und Zellmembranintegrität) und histopathologische Analyse gemessen. Abbildung 1 zeigt den Workflow zur Etablierung menschlicher Blasenkrebs-PDOs aus klinischem Material, das während einer elektiven Operation erhalten wurde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während 3D-Organoidprotokolle, die aus Blasenkrebsgewebe gewonnen werden, noch in den Kinderschuhen stecken, sind sie ein Bereich der aktiven Forschung und klinischen Untersuchung. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur erfolgreichen Etablierung von Blasenkrebs-PDOs beschrieben, die sowohl für NMIBC- als auch für MIBC-Proben geeignet sind. Dieser Workflow integriert sich parallel in klinische Studien im Krankenhaus und berücksichtigt die Rückstellung von Biobankproben, einschließlich der histologischen Probenverar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken der technischen Unterstützung des Translational Research Institute Histology Core und der Biological Resource Facility. Diese Forschung wurde durch Mittel aus einem Preis der Princess Alexandra Research Foundation (I.V., E.D.W.) und dem Medical Research Future Fund (MRFF) Rapid Applied Research Translation Program (Centre for Personalised Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Das Translational Research Institute wird von der australischen Regierung unterstützt.
Materials
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
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