Patiënt-afgeleide organoïden (BOB’s) zijn een krachtig hulpmiddel in translationeel kankeronderzoek, dat zowel de genetische als fenotypische heterogeniteit van de ziekte en de reactie op gepersonaliseerde antikankertherapieën weerspiegelt. Hier wordt een geconsolideerd protocol voor het genereren van pdo’s voor primaire blaaskanker bij de mens ter voorbereiding op de evaluatie van fenotypische analyses en medicijnresponsen gedetailleerd beschreven.
De huidige in vitro therapeutische testplatforms zijn niet relevant voor tumorpathofysiologie, waarbij meestal gebruik wordt gemaakt van kankercellijnen die zijn vastgesteld als tweedimensionale (2D) culturen op weefselkweekplastic. Er is een kritieke behoefte aan meer representatieve modellen van tumorcomplexiteit die de therapeutische respons en gevoeligheid nauwkeurig kunnen voorspellen. De ontwikkeling van driedimensionale (3D) ex vivo cultuur van patiënt-afgeleide organoïden (BOB’s), afgeleid van verse tumorweefsels, heeft tot doel deze tekortkomingen aan te pakken. Organoïde culturen kunnen worden gebruikt als tumorsurrogaten parallel aan routinematig klinisch management om therapeutische beslissingen te informeren door potentiële effectieve interventies te identificeren en therapieën aan te geven die nutteloos kunnen zijn. Hier is deze procedure bedoeld om strategieën en een gedetailleerd stapsgewijs protocol te beschrijven om blaaskanker-BOB’s vast te stellen uit vers, levensvatbaar klinisch weefsel. Onze gevestigde, geoptimaliseerde protocollen zijn praktisch om 3D-culturen op te zetten voor experimenten met beperkt en divers uitgangsmateriaal rechtstreeks van patiënten of patiënt-afgeleid xenograft (PDX) tumormateriaal. Deze procedure kan ook worden gebruikt door de meeste laboratoria die zijn uitgerust met standaard weefselkweekapparatuur. De organoïden die met behulp van dit protocol worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt als ex vivo surrogaten om zowel de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan urologische kankerpathologie als om behandelingen te evalueren om klinisch management te informeren.
Blaaskanker is de meest voorkomende urinewegkanker en de tiende meest voorkomende menselijke maligniteit wereldwijd1. Het omvat een genetisch divers en fenotypisch complex spectrum van ziekte2. Urotheliale niet-spierinvasieve vormen van blaaskanker (NMIBC) zijn de meest voorkomende blaaskankerdiagnoses (70% -80%), en deze kankers vertonen aanzienlijke biologische heterogeniteit en variabele klinische uitkomsten 2,3,4. Patiënten met NMIBC ervaren doorgaans een hoog risico op recidief van de ziekte (50-70%) en een derde van de kankers zal zich ontwikkelen en zich ontwikkelen tot aanzienlijk agressievere spierinvasieve blaaskanker (MIBC)2. Hoewel de 5-jaarsoverleving voor NMIBC hoog is (>90%), moeten deze patiënten langdurig klinisch beheer ondergaan5. Aan de andere kant wordt lokaal geavanceerde (niet-reseceerbare) of gemetastaseerde MIBC over het algemeen als ongeneeslijk beschouwd6. Bijgevolg heeft blaaskanker een van de hoogste levenslange behandelingskosten binnen de kankerzorg en is het een aanzienlijke last voor zowel het individu als het gezondheidszorgsysteem 3,7. De onderliggende genetische afwijkingen bij gevorderde ziekten maken het therapeutisch beheer van blaaskanker tot een klinische uitdaging, en de therapeutische opties voor invasieve urotheliale tumoren zijn pas onlangs verbeterd sinds de goedkeuring van immunotherapieën voor zowel geavanceerde als hoogrisico NMIBC 8,9. Momenteel wordt de klinische besluitvorming geleid door conventionele klinische en histopathologische kenmerken, ondanks individuele blaaskankertumoren die grote verschillen vertonen in ziekte-agressiviteit en respons op therapie10. Er is dringend behoefte aan een versnelling van het onderzoek naar klinisch bruikbare modellen om de voorspelling van de prognose van individuele patiënten en de identificatie van effectieve behandelingen te verbeteren.
Driedimensionale (3D) organoïden vertonen een groot potentieel als tumormodellen vanwege hun vermogen om zichzelf te organiseren en de intrinsieke in vivo architectuur en het farmacogenomische profiel van de oorspronkelijke tumor samen te vatten, en hun vermogen om de inheemse cellulaire functionaliteit van het oorspronkelijke weefsel waaruit ze zijn afgeleid te spiegelen 11,12,13 . Hoewel gevestigde blaaskankercellijnen direct beschikbaar, relatief kosteneffectief, schaalbaar en eenvoudig te manipuleren zijn, slagen de in vitro cellijnen er grotendeels niet in om het spectrum van diverse genetische en epigenetische veranderingen na te bootsen die zijn waargenomen bij klinische blaaskankers12,14 en werden ze allemaal vastgesteld en onderhouden onder 2D, adherente kweekomstandigheden. Bovendien herbergen cellijnen afgeleid van primaire en gemetastaseerde blaastumoren significante genetische divergentie van het oorspronkelijke tumormateriaal. 8,15.
Een alternatieve benadering is het gebruik van genetisch gemanipuleerde en kankerverwekkende muismodellen. Hoewel deze modellen enkele van de natuurlijke oncogene cascades die betrokken zijn bij menselijke neoplasie samenvatten (beoordeeld in refs 16,17,18), missen ze tumorheterogeniteit, zijn ze duur, vertegenwoordigen ze slecht invasieve en gemetastaseerde blaaskanker en zijn ze niet levensvatbaar voor snelle drugstests omdat tumoren vele maanden kunnen duren om zich te ontwikkelen14,19 . Patiënt-afgeleide modellen van kanker (inclusief organoïden, voorwaardelijk geherprogrammeerde primaire celcultuur en xenografts) bieden onschatbare mogelijkheden om de effecten van medicamenteuze behandeling vóór klinische behandeling te begrijpen20. Desondanks gebruiken maar weinig groepen routinematig deze patiënt-proximale modellen vanwege de beperkte toegang tot vers primair patiëntweefsel en de uitgebreide optimalisatie die nodig is om reproduceerbaar patiënt-afgeleide organoïde (PDO) kweekomstandigheden te genereren. In een in vivo setting kunnen oncogene cellen interageren en communiceren met verschillende samenstellingen van de omringende bestanddelen, waaronder stromale cellen, weefselinfiltrerende immuuncellen en matrix12. Evenzo kan voor BOB’s die in een 3D-indeling worden gekweekt, cellulaire / matrixcomplexiteit worden aangepast om andere relevante componenten op te nemen. BOB’s kunnen snel worden gegenereerd en kunnen vaak uitgebreid worden doorgegeven of gecryopreserveerd voor later gebruik, ondanks een eindige levensduurvan 21,22,23. Farmacodynamiek (d.w.z. respons op een geneesmiddel) kan worden geëvalueerd met behulp van meerdere uitlezingen, waaronder organoïde levensvatbaarheid en morfologie, en karakterisering van immunohistochemische doelen of transcriptionele veranderingen.
Hier worden de procedures voor de vaststelling van blaaskankerorganoïden uit patiëntmateriaal verzameld uit transurethrale resectie van blaastumor (TURBT) of chirurgische verwijdering van de blaas (radicale cystectomie) beschreven. De methode om BOB’s te genereren wordt geïllustreerd met behulp van direct beschikbare natte laboratoriummaterialen en -gereedschappen. Eindpunten omvatten veranderingen in celmorfologische kenmerken en levensvatbaarheid. Deze werden gemeten met behulp van fluorescentiemicroscopie, in vitro levensvatbaarheid (metabole en celmembraanintegriteit) assays en histopathologische analyse. Figuur 1 toont de workflow voor het vaststellen van PDO’s voor blaaskanker bij de mens uit klinisch materiaal verkregen tijdens electieve chirurgie.
Hoewel 3D-organoïdeprotocollen afgeleid van blaaskankerweefsel nog in de kinderschoenen staan, zijn ze een gebied van actief onderzoek en klinisch onderzoek. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven om met succes blaaskanker-BOB’s vast te stellen die geschikt zijn voor zowel NMIBC- als MIBC-monsters. Deze workflow integreert parallel in ziekenhuisgebaseerde klinische onderzoeken en houdt rekening met de opbouw van biobankmonsters, inclusief histologische monsterverwerking en vers ingevroren weefselbankieren, w…
The authors have nothing to disclose.
We erkennen de technische bijstand van het Translational Research Institute Histology core en Biological Resource Facility. Dit onderzoek werd ondersteund door financiering van een Princess Alexandra Research Foundation award (I.V., E.D.W.), en het Medical Research Future Fund (MRFF) Rapid Applied Research Translation Program (Centre for Personalised Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Het Translational Research Institute krijgt steun van de Australische overheid.
1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
37°C incubator | |||
37°C water bath | |||
50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
6-well plate | Corning | CLS3516 | |
70% (w/w) ethanol | |||
-80°C freezer | |||
96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
Computer system | |||
CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
Dry and wet ice | |||
Esky | |||
Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
Liquid nitrogen | |||
Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
Scale | |||
Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
Urine specimen jar | |||
Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |