Coltura di organoidi del cancro della vescica come strumenti di medicina di precisione
Summary
Gli organoidi derivati dal paziente (DOP) sono un potente strumento nella ricerca traslazionale sul cancro, che riflette sia l’eterogeneità genetica che fenotipica della malattia e la risposta alle terapie antitumorali personalizzate. Qui, viene dettagliato un protocollo consolidato per generare DOP di carcinoma della vescica primario umano in preparazione per la valutazione delle analisi fenotipiche e delle risposte ai farmaci.
Abstract
Le attuali piattaforme di test terapeutici in vitro non hanno rilevanza per la fisiopatologia tumorale, impiegando tipicamente linee cellulari tumorali stabilite come colture bidimensionali (2D) su coltura tissutale di plastica. C’è un bisogno critico di modelli più rappresentativi della complessità tumorale in grado di prevedere con precisione la risposta terapeutica e la sensibilità. Lo sviluppo di colture tridimensionali (3D) ex vivo di organoidi derivati dal paziente (DOP), derivati da tessuti tumorali freschi, mira ad affrontare queste carenze. Le colture organoidiche possono essere utilizzate come surrogati tumorali in parallelo alla gestione clinica di routine per informare le decisioni terapeutiche identificando potenziali interventi efficaci e indicando terapie che possono essere inutili. Qui, questa procedura mira a descrivere strategie e un protocollo dettagliato passo-passo per stabilire DOP di cancro alla vescica da tessuto clinico fresco e vitale. I nostri protocolli consolidati e ottimizzati sono pratici per impostare colture 3D per esperimenti utilizzando materiale di partenza limitato e diversificato direttamente dai pazienti o materiale tumorale allo xenotrapianto derivato dal paziente (PDX). Questa procedura può essere impiegata anche dalla maggior parte dei laboratori dotati di attrezzature standard per la coltura dei tessuti. Gli organoidi generati utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati come surrogati ex vivo per comprendere sia i meccanismi molecolari alla base della patologia urologica del cancro sia per valutare i trattamenti per informare la gestione clinica.
Introduction
Il cancro della vescica è il tumore del tratto urinario più diffuso e il decimo tumore maligno umano più comune in tutto il mondo1. Comprende uno spettro geneticamente diversificato e fenotipicamente complesso della malattia2. Le forme uroteliali non muscolo-invasive di cancro della vescica (NMIBC) sono le diagnosi più comuni di cancro alla vescica (70%-80%), e questi tumori mostrano una notevole eterogeneità biologica e risultati clinici variabili 2,3,4. I pazienti con NMIBC in genere sperimentano un alto rischio di recidiva della malattia (50-70%) e un terzo dei tumori progredirà e si svilupperà in un cancro della vescica muscolo-invasivo significativamente più aggressivo (MIBC)2. Sebbene i tassi di sopravvivenza a 5 anni per NMIBC siano elevati (>90%), questi pazienti devono sottoporsi a gestione clinica a lungo termine5. D’altra parte, la MIBC localmente avanzata (non resecabile) o metastatica è generalmente considerata incurabile6. Di conseguenza, il cancro alla vescica ha uno dei più alti costi di trattamento a vita nell’ambito della cura del cancro ed è un onere significativo sia per l’individuo che per il sistema sanitario 3,7. Le aberrazioni genetiche sottostanti nella malattia avanzata rendono la gestione terapeutica del cancro della vescica una sfida clinica e le opzioni terapeutiche per i tumori uroteliali invasivi sono migliorate solo di recente dall’approvazione delle immunoterapie sia per NMIBC 8,9 avanzato che ad alto rischio. Attualmente, il processo decisionale clinico è stato guidato da caratteristiche cliniche e istopatologiche convenzionali, nonostante i singoli tumori del cancro della vescica mostrino grandi differenze nell’aggressività della malattia e nella risposta alla terapia10. C’è un urgente bisogno di accelerare la ricerca di modelli clinicamente utili per migliorare la previsione della prognosi dei singoli pazienti e l’identificazione di trattamenti efficaci.
Gli organoidi tridimensionali (3D) mostrano un grande potenziale come modelli tumorali grazie alla loro capacità di auto-organizzarsi e ricapitolare l’architettura intrinseca in vivo e il profilo farmacogenomico del tumore originale e la loro capacità di rispecchiare la funzionalità cellulare nativa del tessuto originale da cui sono stati derivati 11,12,13 . Sebbene le linee cellulari consolidate del cancro della vescica siano prontamente disponibili, relativamente convenienti, scalabili e semplici da manipolare, le linee cellulari in vitro in gran parte non riescono a imitare lo spettro di diverse alterazioni genetiche ed epigenetiche osservate nei tumori clinici della vescica12,14 e sono state tutte stabilite e mantenute in condizioni di coltura aderenti 2D. Inoltre, le linee cellulari derivate da tumori della vescica primari e metastatici ospitano una significativa divergenza genetica dal materiale tumorale originale. 8,15.
Un approccio alternativo consiste nell’utilizzare modelli murini geneticamente modificati e indotti da agenti cancerogeni. Tuttavia, mentre questi modelli ricapitolano alcune delle cascate oncogeniche naturali coinvolte nella neoplasia umana (esaminate nei riferimenti 16,17,18), mancano di eterogeneità tumorale, sono costose, rappresentano scarsamente il cancro della vescica invasivo e metastatico e non sono praticabili per test farmacologici a breve termine poiché i tumori possono richiedere molti mesi per sviluppare14,19 . I modelli di cancro derivati dal paziente (inclusi organoidi, colture cellulari primarie riprogrammate condizionatamente e xenotrapianti) offrono preziose opportunità per comprendere gli effetti del trattamento farmacologico prima del trattamento clinico20. Nonostante ciò, pochi gruppi utilizzano abitualmente questi modelli prossimali del paziente a causa dell’accesso limitato al tessuto fresco del paziente primario e dell’ampia ottimizzazione necessaria per generare in modo riproducibile condizioni di coltura organoide (DOP) derivate dal paziente. In un ambiente in vivo, le cellule oncogeniche possono interagire e comunicare con varie composizioni dei costituenti circostanti, tra cui cellule stromali, cellule immunitarie infiltranti nei tessuti e matrice12. Allo stesso modo, per le DOP coltivate in formato 3D, la complessità cellulare / matrice può essere personalizzata per includere altri componenti rilevanti. Le DOP possono essere generate rapidamente e spesso possono essere passate estensivamente o crioconservate per un uso successivo, nonostante abbiano una durata di vita finita 21,22,23. La farmacodinamica (cioè la risposta a un farmaco) può essere valutata utilizzando letture multiple, tra cui la vitalità e la morfologia organoide e la caratterizzazione di bersagli immunoistochimici o cambiamenti trascrizionali.
Qui, vengono descritte le procedure per la creazione di organoidi del cancro della vescica dal materiale del paziente raccolto dalla resezione transuretrale del tumore della vescica (TURBT) o dalla rimozione chirurgica della vescica (cistectomia radicale). Viene illustrato il metodo per generare DOP, utilizzando materiali e strumenti di laboratorio umidi prontamente disponibili. Gli endpoint includono cambiamenti nelle caratteristiche morfologiche e nella vitalità delle cellule. Questi sono stati misurati utilizzando microscopia a fluorescenza, saggi di vitalità in vitro (integrità metabolica e della membrana cellulare) e analisi istopatologica. La Figura 1 mostra il flusso di lavoro per stabilire le DOP del cancro della vescica umana da materiale clinico ottenuto durante la chirurgia elettiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre i protocolli organoidi 3D derivati dal tessuto del cancro della vescica sono ancora nella loro infanzia, sono un’area di ricerca attiva e indagine clinica. Qui, viene dettagliato un protocollo ottimizzato per stabilire con successo le DOP del cancro della vescica adatte sia per i campioni NMIBC che MIBC. Questo flusso di lavoro si integra parallelamente negli studi clinici ospedalieri e considera l’accumulo di campioni di biobanche, tra cui l’elaborazione dei campioni istologici e la banca dei tessuti freschi cong…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo l’assistenza tecnica del nucleo di istologia dell’Istituto di ricerca traslazionale e della struttura delle risorse biologiche. Questa ricerca è stata sostenuta dal finanziamento di un premio della Princess Alexandra Research Foundation (I.V., E.D.W.) e del Medical Research Future Fund (MRFF) Rapid Applied Research Translation Program (Centre for Personalizised Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Il Translational Research Institute riceve il sostegno del governo australiano.
Materials
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
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