Culture des organoïdes du cancer de la vessie comme outils de médecine de précision
Summary
Les organoïdes dérivés du patient (AOP) sont un outil puissant dans la recherche translationnelle sur le cancer, reflétant à la fois l’hétérogénéité génétique et phénotypique de la maladie et la réponse aux thérapies anticancéreuses personnalisées. Ici, un protocole consolidé pour générer des AOP pour le cancer primaire de la vessie humaine en préparation de l’évaluation des analyses phénotypiques et des réponses médicamenteuses est détaillé.
Abstract
Les plateformes actuelles de tests thérapeutiques in vitro manquent de pertinence pour la physiopathologie tumorale, utilisant généralement des lignées cellulaires cancéreuses établies sous forme de cultures bidimensionnelles (2D) sur du plastique de culture tissulaire. Il existe un besoin critique de modèles plus représentatifs de la complexité tumorale capables de prédire avec précision la réponse thérapeutique et la sensibilité. Le développement de la culture ex vivo tridimensionnelle (3D) d’organoïdes dérivés de patients (PDO), dérivés de tissus tumoraux frais, vise à remédier à ces lacunes. Les cultures organoïdes peuvent être utilisées comme substituts de tumeurs parallèlement à la prise en charge clinique de routine pour éclairer les décisions thérapeutiques en identifiant les interventions efficaces potentielles et en indiquant les thérapies qui peuvent être futiles. Ici, cette procédure vise à décrire des stratégies et un protocole détaillé étape par étape pour établir des PDO pour le cancer de la vessie à partir de tissus cliniques frais et viables. Nos protocoles bien établis et optimisés sont pratiques pour mettre en place des cultures 3D pour des expériences utilisant du matériel de départ limité et diversifié directement à partir de patients ou de matériel tumoral de xénogreffe dérivé du patient (PDX). Cette procédure peut également être utilisée par la plupart des laboratoires équipés d’équipements de culture tissulaire standard. Les organoïdes générés à l’aide de ce protocole peuvent être utilisés comme substituts ex vivo pour comprendre à la fois les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathologie urologique du cancer et pour évaluer les traitements afin d’éclairer la prise en charge clinique.
Introduction
Le cancer de la vessie est le cancer des voies urinaires le plus répandu et la dixième tumeur maligne humaine la plus courante dans le monde1. Il englobe un spectre génétiquement diversifié et phénotypiquement complexe de la maladie2. Les formes urothéliales non invasives de cancer de la vessie (NMIBC) sont les diagnostics de cancer de la vessie les plus courants (70 % à 80 %), et ces cancers présentent une hétérogénéité biologique considérable et des résultats cliniques variables 2,3,4. Les patients atteints de NMIBC présentent généralement un risque élevé de récidive de la maladie (50-70%) et un tiers des cancers progresseront et se développeront en un cancer de la vessie invasif musculaire (MIBC) significativement plus agressif2. Bien que les taux de survie à 5 ans pour NMIBC soient élevés (>90%), ces patients doivent subir une prise en charge clinique à long terme5. D’autre part, le MIBC localement avancé (non résécable) ou métastatique est généralement considéré comme incurable6. Par conséquent, le cancer de la vessie a l’un des coûts de traitement à vie les plus élevés dans les soins contre le cancer et représente un fardeau important pour l’individu et le système de santé 3,7. Les aberrations génétiques sous-jacentes dans la maladie avancée font de la prise en charge thérapeutique du cancer de la vessie un défi clinique, et les options thérapeutiques pour les tumeurs urothéliales invasives ne se sont améliorées que récemment depuis l’approbation des immunothérapies pour le NMIBC 8,9 avancé et à haut risque. Actuellement, la prise de décision clinique a été guidée par des caractéristiques cliniques et histopathologiques conventionnelles, malgré les tumeurs individuelles du cancer de la vessie montrant de grandes différences dans l’agressivité de la maladie et la réponse au traitement10. Il est urgent d’accélérer la recherche sur des modèles cliniquement utiles pour améliorer la prédiction du pronostic individuel des patients et l’identification de traitements efficaces.
Les organoïdes tridimensionnels (3D) présentent un grand potentiel en tant que modèles tumoraux en raison de leur capacité à auto-organiser et à récapituler l’architecture in vivo intrinsèque et le profil pharmacogénomique de la tumeur d’origine, et de leur capacité à refléter la fonctionnalité cellulaire native du tissu d’origine à partir duquel ils ont été dérivés 11,12,13 . Bien que les lignées cellulaires établies de cancer de la vessie soient facilement disponibles, relativement rentables, évolutives et simples à manipuler, les lignées cellulaires in vitro ne parviennent en grande partie pas à imiter le spectre de diverses altérations génétiques et épigénétiques observées dans les cancers cliniques de la vessie 12,14 et ont toutes été établies et maintenues dans des conditions de culture adhérente 2D. De plus, les lignées cellulaires dérivées de tumeurs primaires et métastatiques de la vessie présentent une divergence génétique importante par rapport au matériel tumoral d’origine. 8,15.
Une autre approche consiste à utiliser des modèles murins génétiquement modifiés et cancérigènes. Cependant, bien que ces modèles récapitulent certaines des cascades oncogènes naturelles impliquées dans la néoplasie humaine (examinées dans les refs 16,17,18), ils manquent d’hétérogénéité tumorale, sont coûteux, représentent mal le cancer de la vessie invasif et métastatique et ne sont pas viables pour les tests de dépistage rapide des médicaments à terme, car les tumeurs peuvent prendre plusieurs mois à se développer 14,19 . Les modèles de cancer dérivés de patients (y compris les organoïdes, la culture cellulaire primaire reprogrammée conditionnellement et les xénogreffes) offrent des occasions inestimables de comprendre les effets du traitement médicamenteux avant le traitement clinique20. Malgré cela, peu de groupes utilisent systématiquement ces modèles proximaux du patient en raison de l’accès limité aux tissus primaires frais du patient et de l’optimisation étendue nécessaire pour générer de manière reproductible des conditions de culture organoïdes dérivées du patient (AOP). Dans un contexte in vivo, les cellules oncogènes peuvent interagir et communiquer avec diverses compositions des constituants environnants, y compris les cellules stromales, les cellules immunitaires infiltrant les tissus et la matrice12. De même, pour les PDO développés dans un format 3D, la complexité cellulaire/matricielle peut être personnalisée pour inclure d’autres composants pertinents. Les PDO peuvent être générés rapidement et peuvent souvent être largement passés ou cryoconservés pour une utilisation ultérieure, malgré une durée de vie limitéede 21,22,23. La pharmacodynamique (c.-à-d. la réponse à un médicament) peut être évaluée à l’aide de plusieurs lectures, y compris la viabilité et la morphologie organoïdes, et la caractérisation des cibles immunohistochimiques ou des changements transcriptionnels.
Ici, les procédures pour l’établissement d’organoïdes du cancer de la vessie à partir de matériel patient collecté lors de la résection transurétrale de la tumeur de la vessie (TURBT) ou de l’ablation chirurgicale de la vessie (cystectomie radicale) sont décrites. La méthode de génération des AOP est illustrée à l’aide de matériaux et d’outils de laboratoire humides facilement disponibles. Les critères d’évaluation comprennent les changements dans les caractéristiques morphologiques et la viabilité des cellules. Ceux-ci ont été mesurés à l’aide de la microscopie à fluorescence, de tests de viabilité in vitro (intégrité métabolique et de la membrane cellulaire) et d’analyses histopathologiques. La figure 1 montre le flux de travail pour établir les AOP du cancer de la vessie humaine à partir du matériel clinique obtenu lors d’une chirurgie élective.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que les protocoles organoïdes 3D dérivés du tissu cancéreux de la vessie en soient encore à leurs balbutiements, ils constituent un domaine de recherche active et d’investigation clinique. Ici, un protocole optimisé pour établir avec succès des AOP pour le cancer de la vessie qui conviennent à la fois aux échantillons NMIBC et MIBC est détaillé. Ce flux de travail s’intègre parallèlement aux essais cliniques en milieu hospitalier et tient compte de l’accumulation d’échantillons de biobanques, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons l’assistance technique du noyau de l’Institut de recherche translationnelle en histologie et de l’Installation de ressources biologiques. Cette recherche a été financée par une bourse de la Princess Alexandra Research Foundation (I.V., E.D.W.) et par le programme rapid de traduction en recherche appliquée du Medical Research Future Fund (MRFF) (Centre for Personalized Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Le Translational Research Institute reçoit le soutien du gouvernement australien.
Materials
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
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