정밀 의학 도구로서의 방광암 오가노이드의 문화
Summary
환자 유래 오가노이드 (PDO)는 질병의 유전 적 및 표현형 이질성과 개인화 된 항암 요법에 대한 반응을 모두 반영하는 번역 암 연구의 강력한 도구입니다. 여기서, 표현형 분석 및 약물 반응의 평가를 위한 준비로 인간 원발성 방광암 PDOs를 생성하기 위한 통합 프로토콜이 상세히 설명된다.
Abstract
현재의 시험관내 치료 시험 플랫폼은 종양 병태생리학과의 관련성이 결여되어 있으며, 일반적으로 조직 배양 플라스틱 상에서 2차원(2D) 배양물로서 확립된 암 세포주를 채용하고 있다. 치료 반응과 민감도를 정확하게 예측할 수 있는 종양 복잡성에 대한 보다 대표적인 모델에 대한 절실한 필요성이 존재한다. 신선한 종양 조직으로부터 유래된 환자 유래 오가노이드(PDOs)의 3차원(3D) 생체외 배양의 개발은 이러한 단점을 해결하는 것을 목표로 한다. 오가노이드 배양은 일상적인 임상 관리와 병행하여 종양 대리자로 사용되어 잠재적 인 효과적인 개입을 확인하고 쓸모없는 치료법을 나타냄으로써 치료 결정을 알릴 수 있습니다. 여기에서이 절차는 신선하고 실행 가능한 임상 조직에서 방광암 PDO를 확립하기위한 전략과 상세한 단계별 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 우리의 잘 정립되고 최적화된 프로토콜은 환자 또는 환자 유래 이종이식편(PDX) 종양 물질로부터 직접 제한적이고 다양한 출발 물질을 사용하여 실험을 위한 3D 배양물을 설정하는 데 실용적입니다. 이 절차는 표준 조직 배양 장비를 갖춘 대부분의 실험실에서도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 생성 된 오가노이드는 비뇨기과 암 병리학을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 이해하고 임상 관리를 알리기위한 치료법을 평가하기 위해 생체외 대리자로 사용할 수 있습니다.
Introduction
방광암은 가장 널리 퍼진 요로 암이며 전 세계적으로 10 번째로 흔한 인간 악성 종양입니다1. 그것은 유전적으로 다양하고 표현형적으로 복잡한 스펙트럼의 질병2를 포괄한다. Urothelial non-muscle-invasive form of bladder cancer (NMIBC)는 방광암 진단 (70 % -80 %)의 가장 흔한 방광암 진단이며, 이러한 암은 상당한 생물학적 이질성 및 가변 임상 결과 2,3,4를 나타냅니다. NMIBC 환자는 일반적으로 질병 재발 위험이 높으며 (50-70 %), 암의 삼분의 일은 진행되어 훨씬 더 공격적인 근육 침습성 방광암 (MIBC)2로 발전합니다. NMIBC에 대한 5년 생존율은 높지만(>90%), 이들 환자는 장기적인 임상 관리를 받아야 한다5. 한편, 국부적으로 진행된(unresectable) 또는 전이성 MIBC는 일반적으로 난치성6으로 간주된다. 결과적으로, 방광암은 암 치료 내에서 가장 높은 평생 치료 비용 중 하나를 가지며 개인 및 건강 관리 시스템 3,7 모두에게 상당한 부담입니다. 진행성 질환의 근본적인 유전 적 수차는 방광암의 치료 관리를 임상 적 도전으로 만들고, 침습성 비뇨 생식기 종양에 대한 치료 옵션은 진행성 및 고위험 NMIBC 8,9에 대한 면역 요법의 승인 이후 최근에야 개선되었습니다. 현재, 임상 의사 결정은 개별 방광암 종양이 질병 공격성 및 요법10에 대한 반응에서 큰 차이를 보임에도 불구하고 종래의 임상 및 조직병리학적 특징에 의해 유도되었다. 개별 환자의 예후 예측과 효과적인 치료법의 식별을 개선하기 위해 임상적으로 유용한 모델에 대한 연구를 가속화해야 할 긴급한 필요성이 있습니다.
3차원 (3D) 오가노이드는 원래 종양의 내재적 생체 내 구조 및 약물 게놈 프로파일을 스스로 조직하고 재구성하는 능력과 이들이 유래 된 원래 조직의 고유 한 세포 기능을 반영하는 능력으로 인해 종양 모델로서 큰 잠재력을 보여줍니다11,12,13 . 확립된 방광암 세포주는 쉽게 이용가능하고, 비교적 비용 효율적이고, 확장 가능하고, 조작하기 간단하지만, 시험관내 세포주는 임상 방광암(12,14)에서 관찰된 다양한 유전적 및 후성유전학적 변화의 스펙트럼을 모방하는 데 크게 실패하고, 모두 2D, 부착성 배양 조건 하에서 확립되고 유지되었다. 추가적으로, 원발성 및 전이성 방광 종양으로부터 유래된 세포주는 원래의 종양 물질로부터 유의한 유전적 발산을 보유한다. 8,15년.
대안적인 접근법은 유전자 조작 및 발암물질 유발 마우스 모델을 사용하는 것이다. 그러나 이러한 모델은 인간 신생물에 관여하는 자연 종양성 캐스케이드 중 일부를 재검토하지만 (refs 16,17,18에서 검토), 종양 이질성이 부족하고 비용이 많이 들며 침습성 및 전이성 방광암을 제대로 나타내지 않으며 종양이 발병하는 데 수개월이 걸릴 수 있으므로 신속한 약물 검사에는 불가능합니다14,19 . 환자 유래 암 모델(오가노이드, 조건부로 재프로그램된 일차 세포 배양물, 및 이종이식편 포함)은 임상 치료20 전에 약물 치료의 효과를 이해할 수 있는 귀중한 기회를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 신선한 일차 환자 조직에 대한 제한된 접근과 환자 유래 오가노이드 (PDO) 배양 조건을 재현 가능하게 생성하는 데 필요한 광범위한 최적화로 인해 이러한 환자 근위 모델을 일상적으로 사용하는 그룹은 거의 없습니다. 생체내 환경에서, 발암성 세포는 기질 세포, 조직 침윤 면역 세포, 및 매트릭스(12)를 포함하는 주변 구성성분의 다양한 조성물과 상호작용하고 통신할 수 있다. 마찬가지로, 3D 포맷으로 성장한 PDO의 경우, 셀룰러/매트릭스 복잡성은 다른 관련 컴포넌트를 포함하도록 커스터마이즈될 수 있다. PDO는 신속하게 생성될 수 있고, 종종 유한한 수명(21,22,23)을 가짐에도 불구하고, 광범위하게 계대되거나 나중에 사용하기 위해 동결보존될 수 있다. 약력학(즉, 약물에 대한 반응)은 오가노이드 생존력 및 형태학, 면역조직화학 표적의 특성화 또는 전사 변화를 포함하는 다중 판독을 사용하여 평가될 수 있다.
여기에서, 방광 종양의 경요도 절제술 (TURBT) 또는 방광의 외과적 제거 (라디칼 방광 절제술)로부터 수집 된 환자 물질로부터 방광암 오가노이드를 확립하는 절차가 기술되어 있다. PDO를 생성하는 방법은 쉽게 구할 수있는 습식 실험실 재료 및 도구를 사용하여 설명됩니다. 종점은 세포 형태학적 특성 및 생존력의 변화를 포함한다. 이들은 형광 현미경, 시험관내 생존력 (대사 및 세포막 완전성) 분석, 및 조직병리학적 분석을 사용하여 측정되었다. 도 1은 선택 수술 동안 수득된 임상 물질로부터 인간 방광암 PDO를 확립하기 위한 워크플로우를 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
방광암 조직에서 파생 된 3D 오가노이드 프로토콜은 아직 초기 단계에 있지만 활발한 연구 및 임상 조사 영역입니다. 여기서, NMIBC 및 MIBC 표본 모두에 적합한 방광암 PDO를 성공적으로 확립하기 위한 최적화된 프로토콜이 상세히 설명된다. 이 워크플로우는 병원 기반 임상 시험에 병행하여 통합되며 조직학적 샘플 처리 및 임상 오가노이드 파이프라인의 중요한 고려 사항인 신선한 냉동 조직 뱅킹?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Translational Research Institute Histology 핵심 및 Biological Resource Facility의 기술 지원을 인정합니다. 이 연구는 알렉산드라 공주 연구 재단 상 (I.V., E.D.W.)과 의학 연구 미래 기금 (MRFF) 신속한 응용 연구 번역 프로그램 (암 맞춤형 분석 센터 (CPAC; E.D.W., I.V.). Translational Research Institute는 호주 정부의 지원을 받습니다.
Materials
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
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