תרבית של אורגנואידים של סרטן שלפוחית השתן ככלי רפואה מדויקת
Summary
אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) הם כלי רב עוצמה בחקר הסרטן התרגומי, המשקף הן את ההטרוגניות הגנטית והן את ההטרוגניות הפנוטיפית של המחלה ואת התגובה לטיפולים אנטי-סרטניים מותאמים אישית. כאן מפורט פרוטוקול מאוחד ליצירת PDOs ראשוניים של סרטן שלפוחית השתן האנושית כהכנה להערכת ניתוחים פנוטיפיים ותגובות לתרופות.
Abstract
פלטפורמות הבדיקה הטיפוליות הנוכחיות במבחנה חסרות רלוונטיות לפתופיזיולוגיה של הגידול, ובדרך כלל משתמשות בקווי תאים סרטניים המבוססים כתרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות) על פלסטיק תרבית רקמה. יש צורך קריטי במודלים מייצגים יותר של מורכבות הגידול שיכולים לחזות במדויק את התגובה והרגישות הטיפולית. הפיתוח של תרבית ex vivo תלת-ממדית (3D) של אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs), הנגזרים מרקמות גידול טריות, נועד לטפל בחסרונות אלה. תרביות אורגנואידיות יכולות לשמש כפונדקאיות גידול במקביל לניהול קליני שגרתי כדי לקבל החלטות טיפוליות מושכלות על ידי זיהוי התערבויות יעילות פוטנציאליות וציון טיפולים שעשויים להיות חסרי תוחלת. כאן, הליך זה נועד לתאר אסטרטגיות ופרוטוקול מפורט שלב אחר שלב לביסוס PDOs של סרטן שלפוחית השתן מרקמה קלינית טרייה ובת קיימא. הפרוטוקולים המבוססים והממוטבים שלנו הם מעשיים כדי להגדיר תרביות תלת-ממדיות לניסויים תוך שימוש בחומרי התחלה מוגבלים ומגוונים ישירות ממטופלים או מחומר גידולי קסנוגרפט (PDX) שמקורו בחולה. הליך זה יכול להיות מופעל גם על ידי רוב המעבדות מצוידות בציוד תרבית רקמה סטנדרטי. האורגנואידים הנוצרים באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש כפונדקאיות ex vivo כדי להבין הן את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפתולוגיה של סרטן אורולוגי והן כדי להעריך טיפולים לניהול קליני מושכל.
Introduction
סרטן שלפוחית השתן הוא סרטן דרכי השתן הנפוץ ביותר והממאירות האנושית העשירית בשכיחותה בעולם1. הוא מקיף ספקטרום מגוון מבחינה גנטית ומורכב פנוטיפית של מחלה2. צורות לא פולשניות של סרטן שלפוחית השתן (NMIBC) הן האבחנות הנפוצות ביותר של סרטן שלפוחית השתן (70%-80%), וסוגי סרטן אלה מפגינים הטרוגניות ביולוגית ניכרת ותוצאות קליניות משתנות 2,3,4. חולים עם NMIBC חווים בדרך כלל סיכון גבוה להישנות המחלה (50-70%) ושליש ממקרי הסרטן יתקדמו ויתפתחו לסרטן שלפוחית השתן הפולשני השרירים (MIBC)2 אגרסיבי יותר באופן משמעותי. למרות ששיעורי ההישרדות של NMIBC ל-5 שנים גבוהים (>90%), חולים אלה חייבים לעבור ניהול קליני ארוך טווח5. מצד שני, MIBC מתקדם מקומי (לא ניתן לניתוח) או גרורתי נחשב בדרך כלל לחשיפת מרפא6. כתוצאה מכך, לסרטן שלפוחית השתן יש את אחת מעלויות הטיפול הגבוהות ביותר לכל החיים בטיפול בסרטן והוא מהווה נטל משמעותי הן על הפרט והן על מערכת הבריאות 3,7. הסטיות הגנטיות הבסיסיות במחלות מתקדמות הופכות את הניהול הטיפולי של סרטן שלפוחית השתן לאתגר קליני, ואפשרויות טיפוליות לגידולי אורותל פולשניים השתפרו רק לאחרונה מאז אישור אימונותרפיות עבור NMIBC 8,9 מתקדם ובסיכון גבוה כאחד. נכון לעכשיו, קבלת ההחלטות הקליניות הונחתה על ידי מאפיינים קליניים והיסטופתולוגיים קונבנציונליים, למרות שגידולים בודדים בסרטן שלפוחית השתן מראים הבדלים גדולים באגרסיביות המחלה ובתגובה לטיפול10. יש צורך דחוף להאיץ את המחקר למודלים שימושיים מבחינה קלינית כדי לשפר את החיזוי של פרוגנוזה של מטופלים בודדים וזיהוי של טיפולים יעילים.
אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) מראים פוטנציאל רב כמודלים של גידולים בשל יכולתם לארגן את עצמם ולשחזר את הארכיטקטורה הפנימית של הגידול המקורי in vivo ואת הפרופיל הפרמקוגנומי, ואת יכולתם לשקף את הפונקציונליות התאית הטבעית של הרקמה המקורית שממנה נגזרו 11,12,13 . אף על פי שקווי תאים מבוססים של סרטן שלפוחית השתן זמינים בקלות, חסכוניים יחסית, מדרגיים ופשוטים למניפולציה, קווי התאים במבחנה אינם מצליחים במידה רבה לחקות את הספקטרום של שינויים גנטיים ואפיגנטיים מגוונים שנצפו בסרטן קליני של שלפוחית השתן 12,14 וכולם הוקמו ונשמרו בתנאי תרבית דו-ממדיים ודבקים. בנוסף, קווי תאים שמקורם בגידולים ראשוניים וגרורתיים בשלפוחית השתן הם בעלי סטייה גנטית משמעותית מהחומר הגידולי המקורי. 8,15.
גישה חלופית היא להשתמש במודלים של עכברים מהונדסים גנטית ומושרים על ידי מסרטנים. עם זאת, בעוד שמודלים אלה משחזרים חלק מהמפלים האונקוגניים הטבעיים המעורבים בניאופלזיה אנושית (שנסקרו ב- refs 16,17,18), הם חסרים הטרוגניות של הגידול, הם יקרים, מייצגים בצורה גרועה סרטן שלפוחית שתן פולשני וגרורתי, ואינם ברי קיימא לבדיקות תרופות מהירות מכיוון שגידולים יכולים לקחת חודשים רבים לפתח 14,19 . מודלים שמקורם בחולה של סרטן (כולל אורגנואידים, תרבית תאים ראשונית שתוכנתה מחדש באופן מותנה ושנאת זרים) מספקים הזדמנויות שלא יסולא בפז להבין את ההשפעות של טיפול תרופתי לפני טיפול קליני20. למרות זאת, מעטות הקבוצות שמשתמשות באופן שגרתי במודלים פרוקסימליים אלה של המטופלים בשל גישה מוגבלת לרקמות חדשות של מטופלים ראשוניים והאופטימיזציה הנרחבת הנדרשת כדי ליצור באופן משוחזר תנאי תרבית אורגנואידיים שמקורם בחולה (PDO). בסביבה in vivo, תאים אונקוגניים יכולים לקיים אינטראקציה ולתקשר עם הרכבים שונים של המרכיבים הסובבים אותם, כולל תאים סטרומליים, רקמה החודרת לתאי מערכת החיסון ומטריצה12. באופן דומה, עבור מחשבי כף יד הגדלים בתבנית תלת-ממדית, ניתן להתאים אישית את המורכבות התאית/מטריצה כך שתכלול רכיבים רלוונטיים אחרים. ניתן ליצור PDOs במהירות ולעתים קרובות הם יכולים לעבור באופן נרחב או להקפאה לשימוש מאוחר יותר, למרות שתוחלת החיים שלהם היא 21,22,23. ניתן להעריך פרמקודינמיקה (כלומר, תגובה לתרופה) באמצעות קריאות מרובות, כולל כדאיות ומורפולוגיה של אורגנואידים, ואפיון של מטרות אימונוהיסטוכימיה או שינויי שעתוק.
כאן מתוארים ההליכים להקמת אורגנואידים של סרטן שלפוחית השתן מחומר החולה שנאסף מכריתה טרנס-אורתרלית של גידול בשלפוחית השתן (TURBT) או הסרה כירורגית של שלפוחית השתן (כריתת ציסטה רדיקלית). השיטה ליצירת PDOs מומחשת, תוך שימוש בחומרי מעבדה וכלים רטובים הזמינים בקלות. נקודות הקצה כוללות שינויים במאפיינים המורפולוגיים של התאים ובכדאיות. אלה נמדדו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מבחנים של יכולת הכדאיות החוץ גופית (שלמות ממברנת המטבולית והתא) וניתוח היסטופתולוגי. איור 1 מראה את זרימת העבודה לביסוס PDOs של סרטן שלפוחית השתן האנושית מחומר קליני המתקבל במהלך ניתוח אלקטיבי.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד שפרוטוקולים אורגנואידים תלת-ממדיים שמקורם ברקמת סרטן שלפוחית השתן עדיין בחיתוליהם, הם תחום של מחקר פעיל ומחקר קליני. כאן מפורט פרוטוקול מותאם לביסוס מוצלח של PDOs של סרטן שלפוחית השתן המתאימים הן לדגימות NMIBC והן לדגימות MIBC. זרימת עבודה זו משתלבת במקביל בניסויים קליניים מבוססי בית חולי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בסיוע הטכני של ליבת ההיסטולוגיה של מכון המחקר התרגומי ומתקן המשאבים הביולוגיים. מחקר זה נתמך על ידי מימון מפרס קרן המחקר של הנסיכה אלכסנדרה (I.V., E.D.W.), ותוכנית התרגום היישומי המהירה של הקרן למחקר רפואי (MRFF) (המרכז לניתוח מותאם אישית של סרטן (CPAC; E.D.W., I.V.). מכון המחקר התרגומי מקבל תמיכה מממשלת אוסטרליה.
Materials
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
- Saginala, K., et al. Epidemiology of bladder cancer. Medical Sciences. 8 (1), 15 (2020).
- Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
- Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
- Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
- Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
- Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
- Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
- Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer – the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
- Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
- Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
- Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
- Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
- Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).
