ثقافة سرطان المثانة العضوية كأدوات الطب الدقيق
Summary
تعد المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) أداة قوية في أبحاث السرطان الانتقالية ، مما يعكس عدم التجانس الجيني والمظهري للمرض والاستجابة للعلاجات الشخصية المضادة للسرطان. هنا ، يتم تفصيل بروتوكول موحد لتوليد PDOs لسرطان المثانة الأولية البشرية استعدادا لتقييم تحليلات النمط الظاهري والاستجابات الدوائية.
Abstract
تفتقر منصات الاختبار العلاجي الحالية في المختبر إلى الصلة بالفيزيولوجيا المرضية للورم ، وعادة ما تستخدم خطوط الخلايا السرطانية التي تم إنشاؤها كثقافات ثنائية الأبعاد (2D) على بلاستيك زراعة الأنسجة. هناك حاجة ماسة إلى نماذج أكثر تمثيلا لتعقيد الورم يمكنها التنبؤ بدقة بالاستجابة العلاجية والحساسية. يهدف تطوير ثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) خارج الجسم الحي من المواد العضوية المشتقة من المريض (PDOs) ، المستمدة من أنسجة الورم الطازجة ، إلى معالجة أوجه القصور هذه. يمكن استخدام الثقافات العضوية كبدائل للورم بالتوازي مع الإدارة السريرية الروتينية لإبلاغ القرارات العلاجية من خلال تحديد التدخلات الفعالة المحتملة والإشارة إلى العلاجات التي قد تكون غير مجدية. هنا ، يهدف هذا الإجراء إلى وصف الاستراتيجيات وبروتوكول مفصل خطوة بخطوة لإنشاء PDOs لسرطان المثانة من الأنسجة السريرية الجديدة والقابلة للحياة. بروتوكولاتنا الراسخة والمحسنة عملية لإعداد ثقافات 3D للتجارب باستخدام مواد أولية محدودة ومتنوعة مباشرة من المرضى أو مواد الورم xenograft (PDX) المشتقة من المريض. يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء من قبل معظم المختبرات المجهزة بمعدات زراعة الأنسجة القياسية. يمكن استخدام المواد العضوية التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول كبدائل خارج الجسم الحي لفهم كل من الآليات الجزيئية التي تقوم عليها أمراض سرطان المسالك البولية وتقييم العلاجات لإبلاغ الإدارة السريرية.
Introduction
سرطان المثانة هو سرطان المسالك البولية الأكثر انتشارا وعاشر أكثر الأورام الخبيثة البشرية شيوعا في جميع أنحاء العالم1. وهو يشمل طيفا متنوعا وراثيا ومعقدا ظاهريا من المرض2. تعد الأشكال غير الغازية للعضلات غير الغازية لسرطان المثانة (NMIBC) هي أكثر تشخيصات سرطان المثانة شيوعا (70٪ -80٪) ، وتظهر هذه السرطانات عدم تجانس بيولوجي كبير ونتائج سريرية متغيرة2،3،4. عادة ما يعاني المرضى الذين يعانون من NMIBC من خطر كبير لتكرار المرض (50-70٪) ، وسوف يتطور ثلث السرطانات ويتطور إلى سرطان المثانة الغازي للعضلات (MIBC) الأكثر عدوانية2. على الرغم من أن معدلات البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات ل NMIBC مرتفعة (>90٪) ، يجب على هؤلاء المرضى الخضوع لإدارة سريرية طويلة الأجل5. من ناحية أخرى ، يعتبر MIBC المتقدم محليا (غير القابل للاستئصال) أو النقيلي غير قابل للشفاءبشكل عام 6. وبالتالي ، فإن سرطان المثانة لديه واحدة من أعلى تكاليف العلاج مدى الحياة داخل رعاية السرطان وهو عبء كبير على كل من الفرد ونظام الرعاية الصحية 3,7. الانحرافات الجينية الكامنة في الأمراض المتقدمة تجعل الإدارة العلاجية لسرطان المثانة تحديا سريريا ، ولم تتحسن الخيارات العلاجية للأورام البولية الغازية إلا مؤخرا منذ الموافقة على العلاجات المناعية لكل من NMIBC 8,9 المتقدم وعالي الخطورة. في الوقت الحالي ، تسترشد عملية صنع القرار السريري بالسمات السريرية والنسيجية المرضية التقليدية ، على الرغم من أن أورام سرطان المثانة الفردية تظهر اختلافات كبيرة في عدوانية المرض والاستجابة للعلاج10. هناك حاجة ملحة لتسريع البحث في نماذج مفيدة سريريا لتحسين التنبؤ بتشخيص المريض الفردي وتحديد العلاجات الفعالة.
تظهر المواد العضوية ثلاثية الأبعاد (3D) إمكانات كبيرة كنماذج للورم بسبب قدرتها على التنظيم الذاتي وتلخيص الورم الأصلي الجوهري في بنية الجسم الحي والملف الدوائي الجيني ، وقدرتها على عكس الوظيفة الخلوية الأصلية للنسيج الأصلي الذي اشتقت منه 11،12،13 . على الرغم من أن خطوط خلايا سرطان المثانة الراسخة متاحة بسهولة ، وفعالة نسبيا من حيث التكلفة ، وقابلة للتطوير ، وسهلة التلاعب ، إلا أن خطوط الخلايا في المختبر تفشل إلى حد كبير في محاكاة طيف التغيرات الجينية والجينية المتنوعة التي لوحظت في سرطانات المثانة السريرية 12,14 وتم إنشاؤها جميعا وصيانتها في ظل ظروف ثقافة 2D ، الالتصاق. بالإضافة إلى ذلك، فإن خطوط الخلايا المشتقة من أورام المثانة الأولية والنقيلية تؤوي اختلافا وراثيا كبيرا عن مادة الورم الأصلية. 8,15.
وهناك نهج بديل يتمثل في استخدام نماذج الفئران المهندسة وراثيا والمسرطنة. ومع ذلك ، في حين أن هذه النماذج تلخص بعض الشلالات الطبيعية الورمية المشاركة في الأورام البشرية (تمت مراجعتها في المراجع16،17،18) ، فإنها تفتقر إلى عدم تجانس الورم ، وهي مكلفة ، وتمثل سرطان المثانة الغازي والنقيلي بشكل سيئ ، وغير قابلة للتطبيق لاختبار المخدرات السريع على المدى الطويل لأن الأورام يمكن أن تستغرق عدة أشهر لتطوير14،19 . توفر النماذج المشتقة من المريض من السرطان (بما في ذلك المواد العضوية ، وزراعة الخلايا الأولية المعاد برمجتها بشكل مشروط ، و xenografts) فرصا لا تقدر بثمن لفهم آثار العلاج الدوائي قبل العلاج السريري20. على الرغم من ذلك ، فإن عددا قليلا من المجموعات تستخدم بشكل روتيني هذه النماذج القريبة من المريض بسبب محدودية الوصول إلى أنسجة المريض الأولية الطازجة والتحسين الشامل المطلوب لتوليد ظروف زراعة العضوية المشتقة من المريض (PDO) بشكل متكرر. في بيئة الجسم الحي ، يمكن للخلايا السرطانية أن تتفاعل وتتواصل مع تركيبات مختلفة من المكونات المحيطة ، بما في ذلك الخلايا اللحمية ، والأنسجة التي تتسلل إلى الخلايا المناعية ، والمصفوفة12. وبالمثل ، بالنسبة لشركة تنمية نفط عمان المزروعة بتنسيق 3D ، يمكن تخصيص تعقيد الخلايا / المصفوفة لتشمل المكونات الأخرى ذات الصلة. يمكن إنشاء PDOs بسرعة وغالبا ما تكون قادرة على المرور على نطاق واسع أو حفظها بالتجميد لاستخدامها لاحقا ، على الرغم من أن عمرها محدود21،22،23. يمكن تقييم الديناميكا الدوائية (أي الاستجابة للدواء) باستخدام قراءات متعددة ، بما في ذلك الجدوى العضوية والمورفولوجيا ، وتوصيف أهداف الكيمياء النسيجية المناعية أو تغييرات النسخ.
هنا ، يتم وصف إجراءات إنشاء المواد العضوية لسرطان المثانة من مواد المريض التي تم جمعها من استئصال ورم المثانة عبر الإحليل (TURBT) أو الاستئصال الجراحي للمثانة (استئصال المثانة الجذري). يتم توضيح طريقة توليد PDOs ، باستخدام المواد والأدوات المختبرية الرطبة المتاحة بسهولة. تتضمن نقاط النهاية تغيرات في الخصائص المورفولوجية للخلية وقابليتها للحياة. تم قياس هذه باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، واختبارات الجدوى في المختبر (سلامة الأيض وغشاء الخلية) ، والتحليل النسيجي المرضي. يوضح الشكل 1 سير العمل لإنشاء PDOs لسرطان المثانة البشرية من المواد السريرية التي تم الحصول عليها أثناء الجراحة الاختيارية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن بروتوكولات 3D العضوية المشتقة من أنسجة سرطان المثانة لا تزال في مهدها ، فهي مجال للبحث النشط والتحقيق السريري. هنا ، يتم تفصيل بروتوكول محسن لإنشاء PDOs لسرطان المثانة بنجاح والتي هي مناسبة لكل من عينات NMIBC و MIBC. يتكامل سير العمل هذا بالتوازي مع التجارب السريرية القائمة على المستشفي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعرب عن تقديرنا للمساعدة التقنية التي يقدمها معهد البحوث الانتقالية لعلم الأنسجة الأساسي ومرفق الموارد البيولوجية. تم دعم هذا البحث بتمويل من جائزة مؤسسة الأميرة ألكسندرا للأبحاث (I.V., E.D.W.) ، وبرنامج ترجمة البحوث التطبيقية السريعة التابع لصندوق مستقبل البحوث الطبية (MRFF) (مركز التحليل الشخصي للسرطانات (CPAC; E.D.W., I.V.). ويتلقى معهد البحوث الانتقالية الدعم من الحكومة الأسترالية.
Materials
| 1.2 mL cryogenic vial | Corning | 430487 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | polypropylene single-use tube |
| 100 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27270 | |
| 100 mm petri dish | Corning | 430167 | |
| 10x Collagenase/ Hyaluronidase | STEMCELL Technologies | #07912 | |
| 37 µM reversible strainer | STEMCELL Technologies | #27250 | |
| 37°C incubator | |||
| 37°C water bath | |||
| 50 mL falcon tube | Corning | CLS430829-500EA | |
| 6-well plate | Corning | CLS3516 | |
| 70% (w/w) ethanol | |||
| -80°C freezer | |||
| 96 well ultra low attachment plate (Black) | Sigma-Aldrich | CLS3474-24EA | |
| A 83-01 | BioScientific | 2939 | Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-β |
| ACK lysis buffer | STEMCELL Technologies | #07850 | |
| adDMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Base medium |
| Animal-free recombinant EGF | Sigma | 518179 | Growth factor |
| Automated cell counter (TC20) | Bio-rad | 1450102 | |
| B27 additive | Gibco | 17504044 | Increases sphere-forming efficiency |
| Cell Counting Slides | Bio-rad | 1450015 | |
| Centrifuge | Eppendorf | EP022628188 | |
| Computer system | |||
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | #07930 | Cell freezing solution |
| Dispase II, powder | Thermofisher | 17105041 | To enzymatically disrupt Matrigel |
| DNAse 1 | STEMCELL Technologies | #07900 | |
| DPBS | Thermofisher | 14190144 | |
| Dry and wet ice | |||
| Esky | |||
| Farmdyne (Iodine 16g/L) | Ecolab | ||
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128 | Histological tissue fixative |
| Glutamax (L-alanine-L-glutamine) | Invitrogen | 35050061 | Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | All-purpose buffer |
| Histology cassette | ProSciTech | RCH44-W | |
| Human FGF-10 | Peprotech | 100-26-25 | Growth factor |
| Human FGF-2 | Peprotech | 100-18B-50 | Growth factor |
| Liquid nitrogen | |||
| Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free) | In Vitro Technologies | 356231 | Basement membrane extract (BME) |
| Mr. Frosty freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | cell freezing container |
| N-acetyl-L-cysteine (NAC) | Sigma | A7250 | Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | SIRT-1 inhibitor |
| NikonTs2U inverted microscope | Nikon | MFA510BB | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | MQS31000 | |
| Noggin conditioned media | In-house | BMP inhibitor | |
| Pipetboy acu 2 | Integra | 155000 | |
| Pipettes (p20, p100, p1000) with tips | |||
| Primocin | Jomar Bioscience | ant-pm2 | Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations |
| Prostaglandin E2 (PGE2) | Tocris | 2296 | support proliferation of cells |
| Rotary tube mixer | Ratek | RSM7DC | |
| R-spondin 1 conditioned media | In-house | WNT signalling regulator | |
| SB202190 | Jomar Bioscience | s1077-25mg | Selective p38 MAP kinase inhibitor |
| Scale | |||
| Scalpel handle | Livingstone | WBLDHDL03 | |
| Scalpels, #11 blade | Medical and Surgical Requisites | EU-211-1 | |
| Serological pipettes (5, 10, 25 mL) | |||
| Specimen Waste Bags | Medical Search | SU09125X16 | |
| Urine specimen jar | |||
| Y27632 | Jomar Bioscience | s1049-10mg | Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells |
References
- Saginala, K., et al. Epidemiology of bladder cancer. Medical Sciences. 8 (1), 15 (2020).
- Lindskrog, S. V., et al. An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer. Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).
- Isharwal, S., Konety, B. Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification. Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).
- Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review. BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).
- Batista, R., et al. TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients. Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).
- Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020. Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).
- Williams, S. B., et al. Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-guérin in the veterans affairs health system. JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).
- Zhu, S., et al. Preclinical models for bladder cancer research. Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).
- lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodríguez-Faba, O., Domínguez-Escrig, J. L., Fernández-Gómez, J. M. Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). Actas Urológicas Españolas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).
- Berry, D. L., et al. Treatment decision making in patients with bladder cancer. Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
- Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research. International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer – the role of organoids and patient-derived xenografts. British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).
- Pan, C. X., et al. Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy. PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).
- Gopinathan, A., Tuveson, D. A. The use of GEM models for experimental cancer therapeutics. Disease models & mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).
- Kemp, C. J. Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).
- Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges. Cell. 163 (1), 39-53 (2015).
- Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).
- Liu, W., et al. Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics. Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Kim, I. H., Lee, H. J. Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer. Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).
- Raphael, M. J., Booth, C. M. Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel. Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models. Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Fusco, P., et al. Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours. BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).
- Mullenders, J., et al. Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).
- Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling. Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).
- Santos, C. P., et al. Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity. Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).
- Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research. Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).
